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1、第四章第四章 微生物细胞的破碎微生物细胞的破碎 知识点：知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。的破碎技术，破碎率的测定。 重点：重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。生产情况予以合理的选择。 难点：难点：常用破碎方法的合理选用。常用破碎方法的合理选用。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：）
2、： 微生物微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm/nm20-8020-8010-1310-13100-300100-300100-250100-250层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要组主要组成成肽聚糖肽聚糖（40-90%40-90%）多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖（1-4%1-4%）肽聚糖肽聚糖（5-10%5-10%）脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖（11-22%11-22%）磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖（30-40%30-40%）甘露聚糖甘露聚糖（30%30%）蛋白质蛋白质（6-8%6-8%）脂类脂类（8.5-8
3、.5-13.5%13.5%）多聚糖多聚糖（80-90%80-90%）脂类脂类蛋白质蛋白质一、细胞壁的组成和结构一、细胞壁的组成和结构u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；及革兰氏阳性细菌的坚固；u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；程度和它的厚度；u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状
4、结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 u不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如霉菌、由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如霉菌、酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。二、常用破碎方法二、常用破碎方法分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离
5、困难子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和丝状菌和含有包含体的基因工程菌含有包含体的基因工程菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，具有
6、高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结- -融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活细胞破碎机理图细胞破碎机理图进入
7、珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。套冷却的方式带走。1.珠磨法（珠磨法（Bead mill）原理：原理
8、：高速珠磨机高速珠磨机o 实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速高速组织捣碎机、组织捣碎机、 Braun匀浆器；匀浆器；o 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；o 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。公司和德国西门子机械公司制造）。胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机破碎破碎作用方程作用方程破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：下列公式： ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KtKt 其
9、中其中 R R 破碎率；破碎率； K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数； t t一一 时间。时间。 一级反应速度常数一级反应速度常数K K与许多操作参数有关，如如与许多操作参数有关，如如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。操作条件的选择：珠体大小根据细胞大小、浓度以及连续操作时不使珠体带出来选择。珠体装量装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升高。温度温度高时细胞较易破碎，但要考虑目的产物不受破坏。一般温度控制在540内时影响较
10、小。搅拌转速过高将使能量消耗大增，而破碎率上升不明显。能耗Rn珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：以下：p降低能耗降低能耗p减少大分子目的产物的失活减少大分子目的产物的失活p减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。分离而给后续操作带来的困难。采用采用高压匀浆器高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。公司均有产品出售）。2.高压匀浆法（高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞
11、破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。细胞破碎。原理：原理：高压匀浆器
12、高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器破碎的动力学方程为：破碎的动力学方程为：ln1（lR）KNP 其中其中 R破碎率；破碎率； K与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P一操作压力；一操作压力； N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 与微生物种类有关的常数；与微生物种类有关的常数； 破碎酵母菌破碎酵母菌,值可取值可取2. 2。可见，影响破碎的主要。可见，影响破碎的主要因素是因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。压力、温度和通过匀浆器阀的次数。 p易造成堵塞的团状或丝状真菌易造成堵塞的团状或丝状真菌p较小的革兰氏阳性菌较小的革兰氏阳性菌p含有包含体
13、的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法的细胞类型：不宜采用高压匀浆法的细胞类型： o 思考问题：思考问题：比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？3.喷雾撞击破碎喷雾撞击破碎o 细胞弹性体 刚性体喷雾撞击破碎器结构简图 细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度），细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度），形成粒径小于形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速微米的微粒子。高速载气，氮气流速300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞击板，得
14、以破碎。击板，得以破碎。 3.喷雾撞击破碎喷雾撞击破碎喷雾撞击特点：喷雾撞击特点：（1）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。（2）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力（流速）控）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力（流速）控制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、线制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、线粒体）的回收。粒体）的回收。喷雾撞击破碎特点喷雾撞击破碎特点 喷雾撞击适用于微生物细胞微生物细胞和植物细胞植物细胞的破碎，通常处理悬浮液质量控制
15、浓度为100-200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力为50-500mL/h，而工工业规模的处理能力为业规模的处理能力为10L/h。与其他机械法一样，此种破碎方法也会造成操作系统的温度上升温度上升，破坏生物产品的生物活性，单程操作使温度大约上升10摄氏度。因此，操作系统中必须设有冷却系统冷却系统，以保证生物产品的活性。利用发射利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和空化作用，空穴的形成、增大和闭合产
16、生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。剪切力，使细胞破碎。3.超声破碎法（超声破碎法（Ultrasonication）一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法的效果较差，该法。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎法超声波破碎法3.超声破碎法（超声破碎法（Ultrasonication）其破碎率的相关因素其破碎率的相关因素: 声频、声能；声频、声能；处理时间处理时间细胞浓度细胞浓度菌种类型菌种类型 与破碎效率直接相关的参数与破碎效率直接相关的参数o 振幅，与声能有关，直接影响蛋白释放的比速率振幅，与声能有关，直接影响蛋白释放的比速率o 黏度，影响能耗，抑制空穴现象黏度，影响能耗，抑制空穴现象o 表面张力，添加表面活性剂或者从细胞中释放出蛋白质表面张力，添加表面活性剂或者从细胞中释放出蛋白质等活性物质，会显著影响超声破碎效率。起泡在气等活性物质，会显著影响超声破碎效率。起泡在气-液液界面上会使蛋白质变性或清除空穴现象。界面上会使蛋白质变
