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1、细胞色素P450醮系总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞色素P450酶系（CYP-ECOD）总活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过乙氧基香豆素脱乙基酶反应系统中乙氧基香豆素转化为羟基香豆素后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶系活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素P450酶系的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景细胞色素P450陋是肝细胞微粒体复合功能单加氧化酶系统的总称。其分成五十多个亚酶：CYPl至CYP5L作用在于体内外源化合物（Xen
2、obiotics）,包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation）。乙氧基香豆素脱乙基酶（7-eihoxycoumarinOdeethylase；ECOD）的活性是细胞色素P450酶系的诊断标记，其基于EeoD广泛性催化细胞色素P450亚酶的活性。乙轨基香豆素（7-ethoxycoumarin）在乙氧基香豆素脱乙基酶的催化下，转化为羟基香豆素（7-hydroxycoumarin）后荧光峰值的变化（激发波长368nm,散发波长456nm）,来定量测定细胞色素P450酶系的活性。乙叙基香豆素脱乙基酶反应系统为：ECO
3、D7-ethoxycoumarin+NADPH-*7-hydroxycoumarin+CHjCHO+NADP+产品内容缓冲液(ReagentA)5毫升反应液(ReagentB)500微升底物液(ReagentC)125微升终止液(ReagentD)2毫升标准液(ReagentE)100微升产品说明书1份保存方式保存在一20C冰箱里，反应液（ReagenIB）、底物液（ReagenlC）和标准液（ReagentE）避免光照，终止液（ReagenlD）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器培养箱：用于孵育反应200微升1厘米光径比色皿或黑色96
4、孔板：用于荧光分析的容器荧光分光光度仪过荧光酶标仪：用于荧光分析实验步骤实验开始前，将一20C冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、测定准备1 .准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里2 .设定好荧光分光光度仪（温度为37C）：激发波长370nm,散发波长450nm,并置零3 .准备好5个L5亳升离心管，标记为1至5号管4 .分别加入25微升缓冲液（ReagentA）到每个离心管5 .移取25微升标准液（ReagentE）到1号管，混匀6 .小心移取25微升1号管稀释的标准液（ReagentE）到2号管，混匀7 .小心移取25微升2号管稀释的标准液（Reag
5、entE）到3号管，混匀8 .小心移取25微升3号管稀释的标准液（ReagentE）到4号管，混匀9 .将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号缓冲液（ReagentA）标准液（ReagentE）测定体系标准羟基香豆素浓度125微升25微升1微摩尔/升225微升25微升1号管0.5微摩尔/升325微升25微升2号管0.25微摩尔/升425微升25微升3号管0.125微摩尔/升525微升空对照O二、标准曲线测定1 .移取155微升缓冲液（ReagentA）到1.5毫升离心管2 .力H入20微升反应液（ReagentB）3 .加入5微升底物液（ReagentC）4 .加入20微升
6、上述配制的标准样品5 .上下倾倒数次，混匀6 .在37C温度下孵育15分钟，避免光照7 .力口入75微升终止液（ReagentD）,混匀8 .在37C温度下孵育5分钟，避免光照9 .转移到新的比色皿或黑色96孔板10 .即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（ReIatiVeFlUoreSCenCeUnit；RFU）11 实际荧光单位：标准样相对荧光读数一5号管标准样荧光读数（作为空对照）12.构建标准曲线：纵座标（Y轴）为实际相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准羟基香豆素浓度（微摩尔/升）样品测定1 .移取155微升缓冲液（ReagentA）至J1.5毫升离心管2
7、.加入20微升反应液（ReagentB）3 .加入5微升底物液（ReagentC）4 .加入20微升待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）5 .上下倾倒数次，混匀6 .在37C温度下孵育15分钟，避免光照7 .加入75微升终止液（ReagentD）,混匀8 .在37C温度下孵育5分钟，避免光照9 .转移到新的比色皿或黑色96孔板10 .即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（RelativeFluorescenceUnil;RFU）11 .实际荧光单位：样品相对荧光读数一5号管标准样荧光读数（作为空对照）12 .根据标准曲线获得样品对
8、应羟基香豆素浓度（微摩尔/升）四、计算样品实际活性根据标准曲线获得样品对应羟基香豆素浓度（微摩尔/升）X0.2（体系容量；毫升）X样品稀释倍数0.02（样品容量；毫升X15（反应时间：分钟）=纳摩尔/毫升/分钟（样品蛋白浓度）毫克/亳升=纳摩尔/毫克/分钟注意事项1 .本产品为25次操作，包括标准测定2 .操作时，须戴手套3 .系统操作过程中，标准液测定只需1次4 .终止液（ReagentD）具有腐蚀性，注意操作安全5 .样品须澄清，至关重要（本公司提供细胞可溶性总蛋白质制备试剂盒HL30002.1）6 .如果酶活性过低，可以增加孵育时间至45分钟（37温度下）7 .荧光测定后，比色皿须清洗彻
9、底8 .建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20微克/100微升；待测样本为细胞悬液，其蛋白浓度为100至200微克/100微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HL30030.1）9 .如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度10 .如果检测血液样品，建议使用体外非细胞系统细胞色素P450酶系总活性荧光定量检测试剂盒一HL18016.211 .细胞色素P450酶系单位活性定义为：在37C,pH7.5条件下，每分钟内能够转化1纳摩尔乙氧基香豆素至羟基香豆素所需的酶量作为一个活性单位12 .本公司提供系列毒理学检测试剂产品质量标准1 .本产品经鉴定性能稳定2 .本产品经鉴定检测敏感
