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1、还原敏感脂质前药提高抗肿瘤作用研究成都医学院李富，黄钊，陈荟潼，岩璐，李进，苏悦，张倩，郑雅鑫(成都医学院药学院结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室，四川省成都市邮编610500；)出版物：DrugDelivery发表时间：2019年11月18日指导老师：郑雅鑫职称：副教授摘要：未经修饰的喜树碱(CPT)水溶性极低，活性内酯环不稳定，严重限制其应用于化疗。在本研究中，含有二硫键的还原敏感型CPT与油酸(OIeiCaCid,OA)的共挽物(CPT-SS-OA)被用来递送内胎环稳定的CPT,以提高抗肿瘤效果，同时构建不含二硫键的CPT-OA作为对照来阐明二硫键的作用。包裹在聚氧乙烯葡麻油胶
2、束(CremophorELmicelles,CM)中的CPT-SSgA和CPT-OA均表现出多种治疗优势：直径小(约14nm)、高效的细胞内化作用、更长的血液循环时间和良好的生物分布。在LLC细胞荷痛小鼠模型中，仅CpT-SS-OA/CM组的化疗效果优于CPT溶液组，可能是由于肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽含量较高加速了含活性内酯环CPT的释放。上述还原敏感脂质前药设计是种可用来递送含活性内酯环CPT的有效方法。该策略亦可用于其他化学不稳定化疗药物的递送，从而提高疗效。ABSTRACT*TherapeuticapplicationofunmodifiedCamptothecin(CPT)isseve
3、relyrestrictedbyitsextremelylowwatersolubilityandtheinstabilityofactivelactonering.Inthisstudy,aredox-sensitiveCPT-OAconjugatecontainingthedisulfidebond(CPT-SS-OA)wasusedtodelivertheIactone-StabilizedCPTfortheimprovedantitumorefficacy.Anon-sensitiveCPT-OAwasusedascontroltoilluminatetheroleofdisulfid
4、ebond.BothCPT-SS-OAandCPT-OAformulatedinCremophorELmicelles(CM)displayedmultipletherapeuticadvantages:smalldiameter(14nm),efficientcellularinternalization,prolongedbloodcirculation,andfavorablebiodistribution.However,onlyCPT-SS-OA/CMachievedthesuperiorchemotherapeuticefficacyoverCPTsolutionintheLewi
5、slungcarcinoma(LLC)cancerxenograft,whichwasascribedtotheacceleratedreleaseoftheactivelactoneCPTrespondingtotheelevatereductiveglutathioneintumorcells.Suchredox-sensitivelipophilicprodrugsrepresentaneffectivealternativestrategyforthedeliveryofCPTintheactivelactoneform.Thisstrategycanbeusedforotherche
6、micallyunstableChemotherapeutantfortheimprovedtherapeuticefficacies.关键词：喜树碱；亲脂性前体药物；抗肿瘤活性；药物输送；氧化还原敏感型KEYWORDS：Camptothecin;lipophilicprodrugs:antitumoractivity;dgdeliverjf;redoxsensitivity国家级大学生创新创业训练计划支持项目O作者摘介8李富（1995-）,男，四川资阳人，药物制剂，2016级，主要从事脂质前药设计及抗肿瘤作用机制研究。一、引言喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种有效的疏水性抗肿瘤
7、药，其平面化学结构导致的高结晶性使其在水中的溶解度非常低而不能直接应用山，还存在不稳定、难释放、毒性大等问题。经调研发现，高疏水性药物的亲脂性前药(TheliPOPhiliCProdrUgSOfhydroPhObiCdrUg,LHPs)设计的纳米聚集体(Nanoaggregates,NAs)具有更强的疏水性，并具有更高的热力学稳定性力。综上，基于PEG修饰(聚乙二醇化)疏水药物的亲脂前药纳米聚集体应运而生。本研究主要探究经二硫键修饰的LHPS是否可以有效地递送经修饰的内酯环稳定型CPT,并对其抗肿瘤活性和作用机制进行深度研究，同时深度评价肿瘤组织还原环境对含二硫键CPT前药的选择性释放机制。二
8、、实验方法(一)CPT-SS-OA/CM和CPT-OA/CM的制备、表征及释放情况成功合成CPT-SS-OA和CPT-C)A,并进一步制得CPT-SS-OA聚氧乙烯茶麻油胶束(CPT-SS-OA/CM)和CPT-OA聚氧乙烯葭麻油胶束(CPT-OA/CM)l4;利用激光粒度仪分别测定两种胶束的粒径大小、粒径分布以及Zeta电位；通过透射电子显微镜观察胶束的形态。使用荧光共振能量转移(FIUoreSCenCeResonanceEnergyTransfer.FRET)技术，利用高效液相(Highperformanceliquidphase,HPLC)技术研究活性药物的释放情况网。(二)药效学与药动
9、学评价基于LLC细胞(LeWiS肺癌细胞)模型，通过荧光显微镜观察细胞摄取活性药物CPT情况：利用MTT法评价胶束细胞毒活性；采用AV-Pl染色法研究胶束诱导细胞凋亡情况。雄性SD大鼠，尾静脉注射相关药物，HPLC法研究药物的体内药动学特点。CT26荷瘤小鼠尾静脉推注DiR标记样品，活体成像系统成像，利用平均荧光强度评价药物组织分布情况。LLC荷瘤小鼠，通过体重变化曲线、肿瘤体积变化曲线、抑痛率，结合天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌好的含量以及HE染色鉴定病理变化，综合评价其抗肿瘤活性。三、结果与讨论(一)CPT-SS-OA/CM与CPT-OA/CM
10、的制备和表征图1CPT-SS-OA的1H-NMR以及CPT-SS-OA/CM(A)与CPT-OA/CM(B)的粒径分布、Zeta电位、透射电镜图基于已合成的CPT-SS-OA和CpT-OA(图1A),我们分别用CrEL对CPT-SS-OA和CPT-OA进行聚乙二醇化修饰，成功制备CPT-SS-OA/CM和CPT-OACPT-OA/CM也如图IB,C所示，两者具有几乎相同的平均粒径(约14nm)、相似的粒径分布、近似的Zeta电位以及同样的球型形态。(二)还原刺激触发CPT释放基于FRET现象原理，我们合成了CUR-OA,成功构建FRET对(图2A,B),并将CPT-OA和CUR-OA共包封于C
11、M中，且CPT的荧光随着CUR-OA用量的增加而逐渐淬灭(图2C),说明可通过可视化的方式检测CPT荧光的动力学变化来监测CPT的释放（图2D）。在DTT的刺激下，孵育后CPT-SSCURCM的CPT荧光强度显著增加,CUR-OA/CM孵育4h未检测到发射光谱的明显变化（图2E,G）。但在10mmolPB（pH7.4）的孵育条件下二者相对稳定（图2F）,上述结果说明含有CPT-SS-CUR/CM的二硫键在还原环境中可能更易断裂，释放出活性药物CPT,具有较强的还原响应性。（三）体外细胞毒性和细胞摄取MTT法测试结果如图3A所示，还原敏感脂质前药的细胞毒性较普通前药高，并能诱导较高的细胞凋亡率（
12、图3B）。研究结果表明LHPS中二硫键在细胞内还原型谷胱甘肽作用下加速药物释放，导致更强的细胞毒活性。荧光显微镜观察细胞对CPT-SS-OA/CM的摄取结果（图3C）显示，两种CPT前药胶束均出现蓝色荧光，溶酶体外还可以观察到广泛的蓝色荧光，说明二者可能通过直接跨膜运输进入LLC细胞。AnncxmV-FITCCXOZVqJLdU图3MTT法测试细胞毒活性及荧光显微观察细胞摄取情况（四）药代动力学及分布情况Time(h)S4CPT-OACM.CPT-SS-OA/CM,CPT单次注射后的血浆浓度-时间曲线级体内药物分布情况体内药代动力学研究结果（图4A）显示，CPT-SS-OA/CM比CpT原药溶
13、液有更长的血液循环时间,有可能使得更多的前药胶束通过EPR效应滞留于肿痛部位回。图4B说明DiR可以稳定地包裹在CM中,可用于药物的体内分布研究。通过观察LLC荷瘤C57小鼠体内DiR标记的CPT-SS-OA-CM和CPT-SS-OA心M荧光强度变化，研究药物的体内分布（图4C）,结果表明CM中的还原敏感脂质前药更易通过EPR效应在肿瘤中聚集。(五)体内抗肿瘤活性研究a=M6MKE3AGUMU)jo voaSalln CPT Solution CPTOACMCPT-SSOACMgQ-dsVBUXSalineCPT solution CFT-OA/CM CPTSSOA/CMSic-OOfoU 3
14、WCQ图5还原敏感脂质前药体内抗肿瘤和毒性研究(n=6),*p.05,*p.001本研究采用LLC细胞荷瘤C57小鼠来评价CPT-OA/CM与CPT-SS-OA/CM的体内抗肿痛效果。如图5A曲线显示，游离药CPT抗肿瘤活性较强，但导致小鼠死亡(图5D),毒性也较强。CPT-SS-OA/CM抗肿瘤活性与CPT组接近，显著优于CpT-OA/CM组(图5A-D),未导致小鼠死亡(图5D)。同时，我们发现各组血尿素氮、肌酎、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等肝、肾功能指标均无显著变化(图5F),说明游离药物与二硫键修饰前药均未表现出显著的肾毒性和肝毒性。此外，HE染色结果显示脂质体给药后主要脏器均无明显病理学
15、变化(图5G)。四、结论本研究合成具有二硫键的还原敏感型亲脂性前药CPT(CPT-SS-OA)用于将具有稳定内酯环的CPT递送至肿瘤细胞，以提高化疗效果。为探究二硫键的作用，将碳酸己基酯(OA)连接的CProA作为非敏感对照。体外研究结果表明，CPT-SS-OA/CM极易进入肿瘤细胞，并转化为活性闭环型CPT,比CPT-OA/CM具有更高的细胞毒性。尽管CPT-SS-OA/CM和CPT-OA/CM均显示出血液循环时间延长和肿瘤积聚作用,但与游离CPT相比，只有CPTSS-OA在异位LLC肺癌细胞模型中显示出更好的抗肿瘤效果。这些结果表明，还原敏感型亲脂性偶联策略可以作为递送活性闭环CPT,提高
16、抗肿瘤作用的有效方法，并为化学稳定性较差的其他疏水性药物的体内递送提供一定参考。参考文献11IBotella,P.andE.Rivero-Buceta,SafeapproachesforCamptothecindelivery:Structuralanaloguesandnanomedicines.JournalofControlledRelease,2017.247:.28-54.2Zheng,Y.,etal.,HydrophobizedSN38toredox-hypersensitivenanorodsforcancertherapy.JournalofMaterialsChemistryB,2019.7(2):p.265-276.3Zeng,J.e(al.,PEGyIationo
