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1、细胞培养中问题及解决1 .如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2 .何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3 .可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以
2、血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(CaIfSenIm)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10%CC)2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-CO32-H作为PH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
3、当培养基中NaHCo3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。7.Hanks平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank,s平衡盐溶液(HBS)和EarIek平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles(2.2gL)中比在Hanks(0.35gL)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，HankS液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要
4、用EagIeS液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用HankS液就可以了。8 .细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9 .悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。10 .冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37。C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超
5、过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。11 .细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSo敏感之细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSo即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。12 .附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20,
6、避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。13 .欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1,OOOrpm),5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。14 .细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和9095%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSo稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。15 .DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissu
7、eculturegrade之DMSO（如SigmaD2650）,其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4。避免反复冷冻解冻造成DMSe）之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMS0,则须使用耐DMSe）之NyIOn材质滤膜。16 .冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于430-60分钟一（-2030分钟*）-8016-18小时（或隔夜）-液氮槽VaPOrPhaSe长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降13至-80以下，再放入液氮槽VaPOrPhaSe长期储存。*-20不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死
8、亡，亦可跳过此步骤直接放入-80。C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。17 .细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial,融合瘤细胞则以5x106cells/mlvial为宜。18 .培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。19 .应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。20 .如果细胞发
9、生微生物污染时，应如何处理？原则上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1 .在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2 .分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，
10、把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25,0.50,1.0,2.0,4,0,8.0mgmlo3 .每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4 .确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5 .在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6 .重复步骤4。7 .在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。21 .支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。22 .支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响
11、所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。23 .侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。24 .CO2培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次）以无菌蒸储水或无菌去离子水更换之。25 .为何培养基保存于4。C冰箱中，颜色会偏暗红色，且PH值会越来越偏碱性？培养基保存于4冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时
12、，可以通入无菌过滤之CO2,以调整PH值。26 .各种细胞培养用的dish,flask是否均相同？不同厂牌的dish或flask,其所COating的Polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。27 .购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。28 .购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现
13、存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80太久。29 .收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。MyCoPIaSma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”(分枝原体，枝原体，类菌质体)，
14、动物医学文献译为“霉形体或支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属(MyCOPlaSma),有几十个种；另一为版原体属(UreaPIaSma),仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解胭胭原体。支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体(Morale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支
15、原体(NLhyorhinis)和菜氏无胆留原体(AJaidlawii),为牛源性。国外调查证明,大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病毒等)、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格
16、选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗
