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1、第六章 微生物的生长及控制第二节 微生物的生长规律第四节 微生物培养法概论目录第一节 测定生长繁殖的方法第三节 影响微生物生长的主要因素第五节 有害微生物的控制第一节 测定生长繁殖的方法 生长 (growth)：个体体积或重量的变化 繁殖 (reproduction)：个体数量的变化 个体生长个体繁殖群体生长 群体生长个体生长 个体繁殖 衡量群体生长的量： 生长量，繁殖数1 纯培养的分离法稀释平皿法平板划线分离法利用选择培养基分离法单细胞挑取法纯种分离 稀释倒平板法划线法单细胞挑取法 这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。 具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴
2、菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细滴管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。 此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。利用选择培养基分离法 不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂（酚）、染料（结晶紫等）、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。 利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择培养基，以便达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。 对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高
3、分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。微生物纯种分离方法的比较稀释平板法稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛平板划线法平板划线法 方法简便，多用于细菌分离单细胞挑取法单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型较特殊的微生物 2.1 测定生长量测定生长量 测体积测体积 称干（湿）重称干（湿）重 菌丝长度测定法菌丝长度测定法 比浊法比浊法 生理指标法：测含氮量生理指标法：测含氮量 测含碳量测含碳量 测磷、测磷、DNA、RNA、ATP
4、 商业上测定生长量的方法商业上测定生长量的方法 生理指标法，电阻抗法，微量量热法，放射法生理指标法，电阻抗法，微量量热法，放射法 2 微生物生长的测定-生长量和繁殖数微生物快速检测设备微生物快速检测设备-奥地利奥地利sy-Lab，Bactrac微生物快速测定（ATP）比浊法turbidity血球计数法（活细胞计数）平板活菌计数法（试剂纸法） 菌落形成单位 (cfu, colony forming unit）膜过滤法 自动计数法稀释摇管法微生物生长的测定2.2 测细胞的个数血球计数法 又被称为又被称为Petroff-Hausser counting。平板活菌计数法平板活菌计数法的两种策略涂布和倾
5、注自动计数法稀释摇管法丝状微生物菌丝长度的测定1. 生长曲线2. 同步生长3. 连续培养第二节 微生物的生长规律细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图细菌接种到细菌接种到定量的定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。以菌数的对数为纵坐标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 四个阶段：四个阶段： 延滞期延滞期 (lag phase) 对数期对数期 (exponential p
6、hase) 稳定期稳定期 (stationary phase) 衰亡期衰亡期 (decline phase, death phase)1.典型生长曲线 (growth curve)生长曲线中各时期的细胞变化情况延滞期 (lag phase)将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期延迟期、适应期。t 细胞形态变大或增长，细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均 长度比刚接种时长
7、长度比刚接种时长6倍。倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；t 细胞内细胞内RNA，尤其是，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，含量增高，合成代谢活跃，核糖体、核糖体、 酶类和酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。的合成加快，易产生诱导酶。t 对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期出现的原因迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解或催化有
8、关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物和必需的生长因子，种子老化（即 调整代谢需要一段适应期）迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。在生产实践中缩短迟缓期的常用手段在生产实践中缩短迟缓期的常用手段(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；尽量使接种前后所使用的
9、培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量适当扩大接种量对数期 (exponential phase) 特点特点生长速率常数最大；生长速率常数最大；代时代时 (generation time)最短；最短；细胞平衡生长；细胞平衡生长；酶系活跃，代谢旺盛。酶系活跃，代谢旺盛。 作为发酵生产的良好种子，可缩短延滞期。作为发酵生产的良好种子，可缩短延滞期。 几个概念几个概念生长速率常数生长速率常数 (growth rate constant): 每小时分裂的代数每小时分裂的代数 R代数代数代时代时细菌细菌培养基培养基温度温度()()代时代时(min)(min)漂浮假单胞菌大肠杆菌蜡状芽孢杆菌嗜热芽孢
10、杆菌乳酸链球菌蕈状芽孢杆菌霍乱弧菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌巨大芽孢杆菌嗜酸乳杆菌褐球固氮菌大豆根瘤菌结核分枝杆菌梅毒密螺旋体肉汤肉汤肉汤肉汤牛乳肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤牛乳葡萄糖葡萄糖合成家兔3737305537373737253037252537379.8171818.326282138273026323166872403444617929321980稳定期 (stationary phase) 稳定期到来的原因：营养物比例失调；积累了有害代谢产物；理化条件不适宜。 特点：生长速率常数为零；菌体产量达最高点；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物，芽孢杆菌开始形成芽孢芽孢，积累次级代谢产物次
11、级代谢产物。营养物质消耗，代谢产物积累、营养物质消耗，代谢产物积累、pH变化变化逐步不适宜于细菌生长逐步不适宜于细菌生长生长速率降低直至零生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。生产上延长稳定期的方法：生产上延长稳定期的方法： 补充营养物质（补料）或取走代谢产物、补充营养物质（补料）或取走代谢产物、 调节调节pH、调节温度、调节温度、 对好氧菌增加通气、搅拌或振荡对好氧菌增加通气、搅拌或振荡获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物与稳定期相关的几个概念初生代谢物 (primary metabolites)
12、次生代谢物 (secondary metabolites)稳定期产物 (idiolites)菌体生长期 (trophophase)代谢产物合成期 (idiophase)衰亡期decline phase; death phase营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出速率，整个群体呈现出负增长负增长。特点：特点：细菌代谢活性降低；细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。
13、菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊； 有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应如何利用生长曲线指导生产种龄：利用对数生长期的种子；延长稳定期；确定放罐时间。采用活菌计数比较麻烦，采用活菌计数比较麻烦，必需严格操作，否则不易得到准确的结果，重复性必需严格操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，也差，在实际工作中多采用在实际工作中多采用分光光度计测定分光光度计测定OD值值的方法绘制的方法绘制细菌的生长曲线。细菌的生长曲线。2.同步生长 (synchronous growth)同步培养同
14、步培养(Synchronous culture)：使群体中的细胞进行同步生长使群体中的细胞进行同步生长培养技术培养技术 群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。同步生长：同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞同步细胞或或同步培养物同步培养物生理与遗传特性的研究；生理与遗传特性的研究；工业发酵的种子；工业发酵的种子；同步培养物同步培养物：一种理想的材料一种理想的材料机械方法机械方法离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术环境条件控制技术温度温度培养基成份
15、控制培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）其他（如光照和黑暗交替培养）获得同步培养物的手段同步生长的生长曲线3.微生物的连续培养 单（分）批培养 (batch culture) 密闭培养 (closed culture) 连续培养 (continuous culture) 开放培养 (open culture)将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。定的比生长
16、速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。稀释率控制生长速率连续培养系统恒化器 (chemostat)使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。生长速率下进行生长繁殖。恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度， 以作为限制性因子，而其他营养物均过量。以作为限制性因子，而其他营养物均过量。限制性因子限制性因子必须是必须是机体生长所必需的营养物质机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度因而可在一定浓度范围内能决定该菌体生长密度范围内能决定该菌体生长密度。恒化器控制指标：稀释率限制性底物浓度恒化器作用：1.长时间保持对数期2. 模拟自然界经常出现的低浓度底物的状态。3. 富集和分离细菌。恒浊器恒浊器恒浊连续培养恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速自动调节
