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1、2022利福平耐药和利福平敏感肺结核患者的气道微生态学（全文）研究背景肺结核是一种呼吸系统的慢性传染病，仍然是导致单一传染病死亡的主要原因之一，但它一直停留在对单一病原体的研究中。最近的研究表明，许多疾病与原生微生物群的破坏有关。在本研究中，我们调查了耐药肺结核与呼吸道微生物菌群之间的相关性。采用高通量16SrRNA基因测序技术对30例肺结核（PTB组）感染患者的呼吸道微生物群组特征进行分析，并与30名健康对照组（H组）进行比较。根据GeneXpertMTB/RIF检测结果，将30例肺结核患者分为药物敏感组（DSO组；12例）和耐药组（DRO组；18例）。将DSO组和DRO组患者呼吸道菌群与H
2、组进行比较。研究方法1 .DNA提取：使用4%NaOH液化每份痰液样本并在PH为6.8的磷酸盐缓冲液中缓冲，然后离心并弃去上清液。留取沉淀后提取DNAo按照制造商说明书，使用NEBnextmicro-biomeDNAenrichmentkit（NewEng1.andBio1.abs,Ipswich1.MA7US）提取微生物群落DNAo使用QubitdsDNABR检测试剂盒（Invitrogen,美国）用Qubit荧光计对DNA进行定量,并通过在1%琼脂玫瑰凝胶上运行等分试样来检查质量。2 .PCR扩增：使用简并PCR引物8F（5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3,）和518R（5-
3、ATTACCGCGGCTGeTGG-3)扩增细菌16SrRNA基因的可变区V1-V3。正向和反向引物都用IHumina适配器、Pad和接头序列标记。在包含30ng模板、聚合酶和PCR主混合物的501.反应中进行PCR富集。PCR循环条件为：943minz9430sz5045s,7245sr7210min,最后延伸IOmin,共30个循环。PCR产物用AmpureXP珠纯化并在洗脱缓冲液中洗脱。文库通过Agi1.ent2100生物分析仪(安捷伦，美国)进行鉴定。经过验证的文库用于按照I1.1.umina的标准流程在I1.IUminaHiSeq平台(BGI,中国深圳)上进行测序，并生成2300bp
4、的双端读取。3 .测序和生物信息学分析：Rawreads被过滤以去除适配器和低质量和模糊的碱基,然后通过Shortreads程序的快速长度调整(F1.ASH,v1.2.11)将双端reads添加到标签中以获得标签。使用UPARSE软件(v70.0.1090)将标签聚类成截止值为97%的OTU,并使用UCHIME(v4.2.40)将嵌合体序列与Go1.d数据库进行比较以进行检测。再使用核糖体数据库项目(RDP汾类器v.2.2对OTU代表性序列进行分类学分类，最小置信度阈值为0.6,并通过QIIMEv1.8.0在Greengenes数据库v201305上进行训练。USEARCH_g1.oba1.用
5、于将所有Tags与OTU进行比对，得到每个样本的OTU丰度统计表。MOTHUR(v1.31.2厢QnMRv1.8.0份别在OTU级别估计了A1.pha和Beta多样性。样本聚类由QIIME(v1.8.0)基于UPGMA进行。使用Rpackagev3.4.1绘制不同分类级别的条形图。使用GraPhIAn创建物种组成的GraPhIan图。主坐标分析（PCoA）由QI1.MRv1.8.0）执行。1.EfSe聚类或1.DA分析由1.EfSe进行。重要的物种或功能由R（v3.4.1）基于Wi1.cox测试或Kruska1.测试确定。研究结果1 .PTB组在A1.pha和Beta多样性方面与H组的差异均有
6、统计学意义，但DSO组和DRO组在A1.pha和Beta多样性方面的差异无统计学意义。另外，细菌多样性香农指数分析显示，DSO组和DRO组细菌菌群均低于H组（户值均V0.001）;而基于unweightedunifrac的DSO组、DRo组和H组的Beta多样性分析显示，DSO组和DRO组的微生物菌群均高于H组（夕值均V0001）具体见图PCoAM02OOg(MO.6PCoA1(25.65%)注蓝色：H组，橙色：PTB组图1基于UnweightedUniFrac距离的PCoA主坐标分析HG DSO DRODSOgroup图2DSO组、DRo组和H组的AIPha多样性分析图3基于unweight
7、edunifrac的DSO组、DRo组和H组的Beta多样性分析2 .PTB组样本与H组呼吸道样本的物种相对丰度存在差异:从PTB组和H组分布收集60份样本，然后进行测序和聚类，通过16SrRNA扩增子分成600个。TU。GreengeneS注释用于将放线菌门、梭杆菌门、拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门鉴定为5个主要门。主要门类是变形菌门和厚壁菌门。相应的优势菌属为奈瑟菌属、嗜血杆菌属、链球菌属和韦荣球菌属。此外，梭杆菌门的主要属是梭杆菌属，而拟杆菌门的主要属是普氏菌属（图4）。在属的水平上，丰度前15种分别为放线菌属、弯曲菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、劳特罗菌属、放线菌属、颗粒菌属、罗氏菌属、梭杆菌
8、属、细线菌属、口卜琳单胞菌属、嗜血杆菌属、韦荣球菌属、链球菌属、奈瑟菌属和普氏菌属（图5）。注描述了样本群落中所有微生物菌群从门到属的等级关系（从内圈到外圈依次排列）。节点大小对应于微生物菌群的平均相对丰度，显示了两者的优势菌群。浅绿色、红色、深绿色、紫色和蓝色分别代表放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和变形菌门图4PTB组和H组优势菌种示意图。Graph1.an展示的分类层次树图5PTB组和H组所有样本细菌种类丰度组成图，主要为15属在门水平上FTB组的变形菌门、梭杆菌门、TM7、SpirochaetesxSR1.Tenericutes的相对丰度均低于H组（分别为25.89%和36.69
9、%、4.76%和9.51%、0.96%和1.75%、0.07%和0.56%、0.18%和0.34%、0.06%和0.16%;户值均0.05）;厚壁菌门和放线菌门的相对丰度均高于H缄分别为40.30%和26.75%、6.30%和2.95%产值均0.05）（图6）。PTB组厚壁菌门较H组主要增加了链球菌（17.59%和12.64%）、韦荣球菌（14.43%和8.65%）和颗粒菌（3.94%和0.74%）（图7）。PTB组放线菌门与H组相比，主要通过罗斯菌（4.57%和1.89%峭加表达在物种水平上是Rothiaaeria（0.219%和0.002%）0两组中相对丰度均1.5%的属水平包括TUriC
10、ibaeteK0.0023%和0）、分枝杆菌（0.03%和0）、放线杆菌（0.533%和0.501%）和Scardovia（0.032%和0.002%）、Atopobium（0.34%和0.139%）、放线菌（1.27%和0.689%）、Roseburia（0.0006%和0）,户值均0.05。PTB组和H组痰标本中前15个菌属的相对丰度有差异的物种是奈瑟菌、流感嗜血杆菌、吓琳单胞菌、梭杆菌和颗粒链球菌（图5）,上述两组前4个属相对丰度的细菌含量分别为17.23%和20.40%、4.61%和10.70%、2.71%和4.43%、1.65%和6.74%,PTB组均低于H组，Wi1.cox秩和检验
11、显示。值分别为0.04、0.00、0.001x0.00;但PTB组中的颗粒链球菌高于H组（3.94%和0.74%）,值为0.03。在物种水平上，PTB组的Vei1.1.one1.1.a_dispar的相对丰度高于H组（10.82%和3.75%（值为Oo1.）;但PTB组的NeiSSeria_sub-f1.ava、HaemophiIuS-ParainfIuenzae、Prevote1.1.a_pa1.1.ens和Prevote1.1.a_nanceiensis的相对丰度分别低于H组（P值均0.05）。值得一提的是，分枝杆菌在整个痰菌群中所占比例很小，相对丰度仅为0.03%o关键属的差异见图70S
12、pecies注*、*和*分别表示两组之间的P值0.001、0.01和0.05图6PTB组和H组在门水平上的相对丰度差异（前10位）J1.205O (O UnPUnq-:注*、*和*分别表示两组之间的夕值0.001、0.01和0.05图7PTB组和H组在属水平上的相对丰度差异（前10）。3.在药物敏感组（DSO）和耐药组（DRO）细菌分布存在差异:DSO组和DRO组的相对丰度（前10位差异均有统计学意义（图8）。DSO组链球菌相对丰度高于DRO组(25.35%和12.41%),主要体现在婴儿链球菌的种属水平上，P005,差异有统计学意义。此外,相对丰度较低的1.aChnOanaerObaCUIUm(0.03%和0.21%)和1.autropia(0.62%和2.23%)在DSO组和DRO组之间差异均有统计学意义，户值均0.05。注DSO组的链球菌相对丰度高于DRO组，Q0.05图8DSO组与DRO组呼吸道样本细菌相对丰度分析研究结论肺结核可引起呼吸道微生物菌群紊乱，其中链球菌的相对丰度在利福平敏感患者和利福平耐药患者之间存在显著差异。
