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1、2023尿液游离DNA在肿瘤分子诊断中的应用价值及研究进展(全文)摘要尿液游离DNA(UCfDNA)中除含有来自泌尿系统细胞裂解释放的DNA片段外，血液游离DNA(CCfDNA)经过肾小球的过滤作用也可以进入尿液中，且UCfDNA与CCfDNA含有的肿瘤DNA所携带的突变信息具有一致性。因此，ucfDNA作为泌尿系统和非泌尿系统肿瘤分子诊断的生物标志物，是近年来液体活检领域的研究热点。UCfDNA在个体化治疗、早期诊断、疗效的动态监测、预后判断等方面具有潜在的应用价值。但是要实现尿液UCfDNA的临床实际应用，还需要解决UCfDNA的提取和精准检测的问题。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见疾病，
2、发病趋势逐年上升。随着医疗技术的发展，通过检测肿瘤基因的突变情况可以实现对疾病的早期筛查、疗效监测、预后判断、应用于个性化用药指导等11.以血液为代表的液体活检是目前肿瘤基因检测的手段之一。液体活检的内容包括血液中游离的循环肿瘤细胞、循环游离DNA(circu1.atingce1.1.-freeDNAzccfDNA循环RNA和外泌体等2,3O此外，唾液、痰液、脑脊液、胸腔积液等体液也可作为少数疾病液体活检的样本来源4oBotezatu等5在2000年从孕妇尿液中检测到胎儿的基因遗传信息，首次证明了CCfDNA可以透肾小球过滤进入到尿液中成为尿液游离DNA(urinece1.1.-freeDNA
3、zucfDNA)的组成部分，且UcfDNA中含有的尿液肿瘤DNA(urinetumorDNA,UtDNA)与ccfDNA中含有的循环肿瘤DNA所携带的基因突变信息具有一致性。此后，UCfDNA在肿瘤分子诊断、病原菌检测、产前筛查等方面进行了大量的研究。作为血液活检的潜在替代样本，尿液相关检测具有无创、时效性强等显著特点，成为近年来液体活检领域的研究热点。本研究以尿液游离DNAm为关键词在PUbMed检索相关文献。对尿液活检的临床应用优势,以及UCfDNA的分子特性、提取和检测方法、在肿瘤分子诊断中的价值进行了归纳总结。发现UCfDNA在个体化治疗、早期诊断、疗效的动态监测、预后判断等方面具有潜
4、在的应用价值。一、尿液活检在临床应用中的优势相对于组织活检以CCfDNA检测为代表的液体活检具有取样简便、快捷、真实反映肿瘤细胞的异质性、结果具有较高的可靠性等优势6o但是,血液的采集需要专门的人员与设备以及特定的场所，对于一些易传染的流行病人群(HIV或者其他病原体)或者年老体弱者存在诸多不便。相对于组织和血液样本，尿液样本在液体活检中具有以下几个优势：(1)尿液的采集量几乎不受限制，完全可以满足检测的需求；(2)可实现高频采样，实现对疾病的动态监测；(3)取样极为方便和简单，不需要专业的人员和设备等；(4)是一种真正无创的采样方式，患者接受程度高；(5)尿液中干扰蛋白、PCR抑制因子含量少
5、，且病原体感染的几率也降低了7o因此，尿液在分子诊断样本来源中具有很好的优势。二、UCfDNA的分子特性UCfDNA按照来源部位可分为两类：一类来源于泌尿系统，如膀胱、泌尿道、肾脏等组织器官中正常细胞或者病变细胞裂解后释放的DNA;另一类来源于非泌尿系统，如机体正常细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞等裂解后释放的DNA首先进入血液中，然后通过肾小球过滤进入尿液中。在尿液活检中一般选择晨尿作为检测样本，收集的尿液中一般加入乙二胺四乙酸,以防止ucfDNA的降解。UcfDNA的浓度范围变化大，如Ohta等8研究发现结直肠癌患者ucfDNA的浓度范围为(1.420)ngm1.另一项在结直肠癌中的
6、研究发现,ucfDNA的浓度变化范围为(1.5-200)ng/m1.9o这2项研究中ucfDNA的浓度范围差异较大，但是中位值接近。尿液中的DNaseI和DNase活性高于血液中这2个酶的活性，因此ucfDNA容易降解，碎片化严重101.所以一般在收集尿液时加入一定浓度的乙二胺四乙酸抑制DNase的活性保护ucfDNA的完整性11oMOUIiere等12通过二代测序(next-generationsequencing,NGS)方法分析了脑胶质瘤患者脑脊液、血浆以及尿液中的CfDNA,结果发现这3种样本中突变的DNA片段中位值要比各样本中含有的正常的CfDNA小20bp左右，如尿液中UtDNA和
7、ucfDNA的长度中位值分别为101bp和133bpo另一项研究中发现，UCfDNA的长度大小主要集中在4292bp130最新研究发现，肿瘤患者的CCfDNA片段化程度高于健康人,健康人ucfDNA片段的特定区域受到保护，而肿瘤患者的ucfDNA片段相同区域则更加碎片化140三、UCfDNA的提取和检测方法多项研究表明，在非泌尿系统肿瘤基因检测中，随着提取CfDNA的尿液体积增大，检测UtDNA的敏感度越接近检测循环肿瘤DNA和组织中肿瘤DNA的敏感度。如在非小细胞肺癌（non-sma1.1.ce1.1.1.ungcancerzNSC1.C）患者EGFR基因检测中发现，收集的尿液样本体积为10
8、89m1.时检测基因的突变阳性率仅为64%而尿液样本体积为90100m1.时，检测基因的阳性突变率达到93%14o在71例KRAS基因突变的肿瘤患者中,UtDNA与肿瘤组织的突变一致性为73%,而其中43份尿液样本量为90-110m1.的肿瘤患者UtDNA与肿瘤组织的突变一致性为89%15O因此，大体积尿液中CfDNA的提取对确保非泌尿系统肿瘤基因检测结果的准确性很有必要。目前，大多数文献报道的提取UCfDNA的方法是使用试剂盒，如柱式提取法、磁珠法、阴离子交换树脂法等16,17,18,但这些试剂盒提取量小。针对提取大体积中UCfDNA的问题，有研究报道使用超滤浓缩器浓缩大体积的尿液至小体积（
9、约4m1.）,然后使用常规小体积提取方法提取19,20o此方法整个流程虽然耗时长（46h）,但这是目前可以从高达100m1.尿液中提取CfDNA的有效方法。OreSkoViC等13在磁珠上固定特异性探针，然后通过杂交的方法可从10m1.尿液中捕获结核杆菌靶序列，然后进一步纯化靶序列后进行PCR检测。由于ucfDNA的突变丰度低，且高度降解,所以近年来报道的检测ucfDNA的方法主要是NGS,数字PCR等方法9,13,21,22oNGS具有通量高、读长短的特性，适合多基因多位点突变的检测，在UCfDNA突变标志物筛选方面应用较广泛；而微滴式数字PCR具有极高的灵敏度，多应用于UCfDNA已知基因
10、突变位点的检测。四、UCfDNA在肿瘤分子诊断中的应用现状UCfDNA在临床诊断中主要应用在肿瘤分子诊断、病原菌检测、无创产前筛查以及器官移植术后排斥反应监测等方面。肿瘤分子诊断可按照人体组织结构分为两部分：泌尿系统肿瘤分子诊断和非泌尿系统肿瘤分子诊断。对于泌尿系统肿瘤（如膀胱癌、前列腺癌、肾癌等），由于病灶与尿液直接接触或距离较近，泌尿系统脱落的肿瘤细胞和DNA片段进入尿液中，所以尿液在泌尿系统肿瘤液体活检中的应用较多。近年来，研究人员针对UCfDNA在非泌尿系统肿瘤（如肺癌、肝癌、脑胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等）的早期诊断、预后判断、个性化治疗、疗效监测等方面进行了大量研究。（-）在
11、泌尿系统肿瘤分子诊断中的应用Christensen等23使用数字PCR方法在监测膀胱癌患者病情进展的研究中发现尿液中FGFR3和PIK3CA的突变丰度与病情进展显著相关。Dud1.ey等24研究发现，在膀胱癌复发的患者中，有91%的患者尿液中检测到了UtDNA（拷贝数变异、核甘酸突变等）,进一步研究发现，92%的患者在病情恶化之前就能在尿液中检测到UtDNAo此外，在泌尿系统肿瘤分子诊断中，尿液沉渣也是重要的样本资源，如XU等25通过检测尿液沉渣中提取的核酸，发现ONECUT2基因的甲基化作为尿路上皮癌独立诊断分子标志物时的敏感度和特异性分别达到89.1%和94.2%oRuan等26使用RPq
12、PCR方法建立的双基因甲基化诊断膀胱癌的模型，以尿液沉渣为核酸来源，结果发现建立的方法对膀胱癌的早期诊断和风险分层具有高敏感度。Hentsche1.等27比较了全尿、离心后的尿液上清和尿沉渣3种样本在膀胱癌诊断中的优缺点，结果发现双基因甲基化诊断膀胱癌的ROC曲线下的面积（AUC）在尿沉渣中最高，达到0.87,相应的敏感度和特异度分别为78.6%和91.7%o以上结果提示我们在泌尿系统肿瘤分子诊断中，尿沉渣样本不应被忽视，或许尿沉渣中存在大量肿瘤来源的细胞。（二）在非泌尿系统肿瘤分子诊断中的应用Reckamp等14利用突变富集PCR结合NGS方法，检测NSC1.C晚期患者尿液和血浆中EGFR基
13、因T790M.1.858R和第19号外显子缺失突变情况，结果发现尿液样本中T790M.1.858R和第19外显子缺失突变的敏感度分别高达93%、80%和83%,在血浆中这3个基因的检测敏感度分别为93%、IoO%和87%在接受靶向药物治疗后，尿液中T790M突变水平在第21天迅速下降。WU等28比较了50例晚期NSC1.C患者的痰、血浆、尿液和肿瘤组织中肿瘤DNA的遗传图谱的差异性,发现血浆、痰液、尿液与组织活检的一致性分别为86%、74%和70%。Mou1.iere等12I:戢了脑胶质瘤患者的脑脊液、血浆和尿液中来源于肿瘤细胞的DNA片段信息结果这3种体液中检测到肿瘤DNA的阳性率分别为7/
14、8、10/12和1016o在肝癌热点突变基因CTNNB1.的研究中发现，13例术前UCfDNA中CTNNB1.基因突变的患者中，接受手术切术后，其中7个患者的CTNNB1.基因突变消除,这7例患者在5年内没有出现复发，而其他6例在术后尿液中检测到突变的患者病情出现复发（包括2例术后突变水平下降的患者）29o1.iu等30施测了肺癌患者血浆和尿液中肿瘤特异性基因的甲基化情况，在血浆和尿液中均检测到癌症特异性位点的DNA甲基化,与对照组相比,癌症患者中的DNA甲基化更为频繁。进一步研究发现，血浆和尿液特异性基因的甲基化均与NSC1.C的诊断相关，与年龄、种族和吸烟量无关。此外，研究表明UCfDNA
15、片段完整性也与肿瘤的发生和发展有关31o本课题组前期使用RT-qPCR方法检测了NSC1.C患者和健康人不同长度的A1.U基因（A1.U-60.A1.U-115和A1.U-247bp厢1.INE1.基因（1.INE1-97和1.INE1.-266bp）片段，结果发现片段浓度和完整性指数（同一基因不同长度片段的浓度比例）在肺癌的早期诊断和肿瘤分期等方面具有很好的应用价值32,330总之，UCfDNA的突变、甲基化以及片段完整性在非泌尿系统肿瘤的早期诊断、疗效和疾病动态监测、预后判断和个体化用药等方面具有重要的应用价值。五、总结对于泌尿系统肿瘤，利用尿液沉渣提取的DNA或者游离DNA的甲基化图谱，对泌尿系统肿瘤的早期诊断、危险分层、预后等具有应用价值。但与基于血液的液体活检相比，尿液在非泌尿系统肿瘤液体活检领域的潜力还未得到充分的探索。UCfDNA中突变基因的丰度低、且高度片段化，因此对UCfDNA的提取和检测要求较高。目前没有公认的UCfDNA提取标准和检测标准。不同的提取方法或检测方法对于同一个样本或许会得出不同的结果。而且UtDNA的检测方法大多使用ddPCR和NGS,这2个方法都具有极高的检测灵敏度，但是成本高且耗时长。
