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1、组蛋白去乙酰化酶3在小鼠心肌纤维化中的作用及机制研究向家培雷玉华*恩施土家族苗族自治州中心医院心血管内科,恩施445000*通讯作者：摘要目的探究组蛋白去乙酰化酶3(Histonedeacetylase3,HDAC3)在异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导的小鼠心肌纤维化中的作用及机制。方法采用ISo皮下多点注射的方式构建小鼠心肌纤维化模型，分别采用HDAC3特异性抑制剂RGFP966干预，二维心脏超声检测小鼠心脏功能参数，包括射血分数(EjeCIiOnfraCIion,EF)、短轴缩短率(fractionshortening,FS)、左室收缩末期内径(LeftVentric
2、ularend-Systolicdiameter.LVESD)和左室舒张末期内径(Lef【ventricularend-diasl。IiCdimension,LVEDD)；马松染色观察各组小鼠心肌纤维化状况；实时荧光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中胶原蛋白1、胶原蛋白3及结缔组织生长因子(ConneCtiVeIiSSUegrOWIhfaCtor,CTGF)的mRNA表达水平；最后，免疫印迹WeSlernblOl检测Klotho及促纤维化相关信号分子的蛋白表达水平。结果ISO刺激可明显上调小鼠心肌组织中HDAC3蛋白表达；RGFP966干预可明显改善ISO刺激所致的小鼠心功能不全，减轻小鼠心肌组
3、织中胶原沉积及纤维化标志物的mRNA表达；机制上，RGFP966可明显上调心肌纤维化小鼠心肌组织中抗纤维化蛋白Klotho的水平，同时阻断Smads信号通路的激活。结论心肌纤维化时,心肌组织HDAC3的蛋白表达水平明显增加，抑制HDAC3可通过上调Klotho改善心肌纤维化。关键词HDAC3,心肌纤维化异丙肾上腺素，KlothoTheRoleandMechanismofHistoneDeacetylase3inCardiacFibrosisinMiceAbstractObjectiveToexploretheroleandmechanismofHistonedeacetylase3(HDAC3
4、)inisoproterenol(ISO)-inducedcardiacfibrosisinmice.MethodsAmousecardiacfibrosismodelwasconstructedbysubcutaneousmulti-pointinjectionofISO.TheHDAC3specificinhibitorRGFP966wasusedtointervene.Two-dimensionalechocardiographywasusedtodetectthecrdiacfunctionparametersofmice,includingejectionfraction(EF)an
5、dfractionshortening(FS),Leftventricularend-systolicdiameter(LVESD)andLeftventricularend-diastolicdimension(LVEDD);Massonstainingwasusedtoobservecardiacfibrosis;real-timequantitativePCRwasusedtodetectthemRNAexpressionlevelsofcollagen1,collagen3,andconnectivetissuegrowthfactor(CTGF)inthecardiactissue;
6、finally,westernblotwasusedtodetecttheproteinexpressionlevelsofKlothoandfibrosis-relatedsignalmolecules.ResultsISOstimulationcansignificantlyIipregulatetheexpressionofHDAC3proteininheart;RGFP966cansignificantlyimprovethecardiacinsufficiencyofmiceinducedbyISO,andreducethemRNAexpressionofcollagendeposi
7、tionandfibrosismarkersinmousemyocardialtissue;,RGFP966cansignificantlyupregulatethelevelofanti-fibrosisproteinKlothointhecardiactissueofmicewithmyocardialfibrosis,thusblockingtheactivationoftheSmadssignalingpathway.ConclusionDuringcardiacfibrosis,theproteinexpressionlevelofHDAC3incardiactissueissign
8、ificantlyincreased.InhibitionofHDAC3canimprovecardiacfibrosisbyUpregulatingKlotho.KeywordsHDAC3,cardiacfibrosis,isoproterenol,Klotho前言心脏纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，包括高血压、心肌梗死、扩张性心肌病和糖尿病心肌病1。在心脏纤维化进程中，细胞外基质和胶原蛋白的大量产生和沉积可显著增加心室肌僵硬度并破坏心功能，特别是舒张功能，最终可导致心力衰竭的发生2。尽管目前，心肌纤维化的调控机制尚不完全明确，但许多研究都已经证实了TGF-WSmad信号通路在心肌纤维
9、化发生发展中的重要地位3卜细胞外的TGF-B可通过活化心脏成纤维细胞上的1型和II型TGF-B受体进而磷酸化胞浆内的Smad2和Smad3。一旦Smad2和Smad3被磷酸化，两者将与Smad4形成复合体进入细胞核，诱导促纤维化相关基因的转录激活4。因此，阻断TGF-Smad信号的活化是预防和治疗心肌纤维化的主要策略之一。组蛋白去乙酰化酶3(Histonedeacetylase3,HDAC3)是组蛋白去乙酰化酶家族的重要成员之一，可通过催化组蛋白去乙酰化，影响染色质结构稳定性并调控基因表达5。既往研究显示，HDAC3对哺乳动物生长发育至关重要；但HDAC3的异常表达也可导致多种疾病的发生6.最
10、近的研究显示，在肾脏纤维化时，肾小管上皮细胞中的HDAC3蛋白表达水平明显升高。而敲低HDAC3可明显抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化，进而抑制肾脏纤维化的进展7。但HDAC3在心肌纤维化中的作用目前尚未被报道，本研究通过构建异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)诱导对的的小鼠心肌纤维化模型,观察HDAC3在小鼠心肌组织中的表达状况，并使用HDAC3特异性抑制剂RGFp966干预，探讨HDAC3影响心肌纤维化的作用及机制，旨在为今后心肌纤维化的预防及治疗提供参考依据。1 .材料与方法1.1 材料与试剂RGFP966（纯度:99.81%,货号：HY-13909）和ISO（纯度
11、:98.61%,货号：HY-B0468）均购自于上海MedChemEXPreSS公司L抗GAPDH（货号ab8245）、KlothO（货号:abl81373）、P-Smad3（货号：ab52903）、T-Smad3（货号：ab208182）.-SMA（货号:ab5831）、HDAC3（货号：ab32369）购自于美国AbCam公司；二抗:羊抗兔IgG（货号:926-32211）购自于美国LICOR公司。1.2 实验动物及心肌纤维化模型的建立本实验中所使用的实验动物为雄性C57BL/6J小鼠购自于湖北省实验动物研究中心、。小鼠周龄约1012周，体质量2363llg。根据随机数表法,将40只小鼠随
12、机分为对照组（Sham组）、RGFP966组、ISo组、ISO+RGFP966组，每组10只。ISO组和ISO+RGFP966组小鼠接受皮下注射ISo（lmgkg,bid）,连续14天。RGFp966及ISO+RGFP966组小鼠于ISo注射当天开始，每天下午接受皮下注射RGFP966（10mgkg,qd）,连续14天。本实验所有操作获实验动物护理和使用委员会批准。1.3 小鼠心脏功能的评价采用MyLab30CV多普勒超声诊断仪器对四组小鼠进行无创心功能检测。使用浓度为L5%的异氟烷对小鼠进行吸入麻醉。待小鼠麻醉成功后，剃去小鼠心前区毛发，充分暴露小鼠皮肤C超声探头频率为30MHz,分别记录穿
13、过左心室前壁和后壁的M型超声，获取小鼠心脏功能参数，包括射血分数（EjeClionfraClion,EF）、短轴缩短率（fractionShorlening,FS）、左室收缩末期内径（LeflVemriCUIarend-SySlOIiCdiameer,LVESD）和左室舒张末期内径（LeIiventricularend-diastolicdimension,LVEDD）o1.4 Westernblot剪取各组小鼠心室肌组织约30mg,充分研磨后在RIPA裂解缓冲液中进行超声裂解C提取各组小鼠心肌组织中的总蛋白C检测各样本蛋白浓度后使用上样缓冲液定容至等浓度，随后分装并置于-80C冰箱长期保存。
14、分别配制10%的分离胶和6%的浓度胶，对各组小鼠心肌蛋白进行SDS-PAGE电泳。待电泳结束后,将蛋白转入醋酸纤维素膜中,并在4C。下使用牛奶封闭40分钟。随后，分别用抗HDAC3xKlothoxP-Smad3、T-Smad3、-SMA和GAPDH的一抗于4C。下孵育过夜，随后于二抗稀释液中避光孵育，置于摇床上1小时。使用化学发光法对目的条带显影并定量C1.5 实时荧光定量PCR使用TRIZoI试剂盒提取各组小鼠心肌组织总RNA,紫外分光计测定纯度和浓度后，对各样本总RNA进行逆转录，获取cDNA。随后，使用ChamQTMSYBRqPCRMaSIerMiX试剂盒对各样本CDNA进行实时荧光定量
15、PCR检测，最终以如aciin作为内参，用才黑。法计算基因的相对表达水平。各基因引物序列如表1所示。表1各基因引物序列GeneSizePrimersequence(5,3,)CollagenI(ColI)198F：Atcgctagtcgtagtcgtagtcr：CgtagtcgtgtagtcgaaaacCollagenIII(ColIII)187F:CCAGCTGATAGTCGArGTCGlAGR：CagtcgatgiaagctagtcgtagConnectivetissuegrowthfactor(CTGF)192f：TgtcgatgcaaagciagccacagR:AACTArGTCGAT
16、GATGCTGATGCGT-aciin202F：CttagciagatgciagtcgiagtcgtR:CCAGTCGATGTCGArGIAGCAGTCGA1.6免疫组织化学染色将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗、抗原修复、羊血清封闭、HDAC3抗体孵育、二抗孵育、DAB显色、脱水、透明及封片等一系列免疫组织化学染色步骤后，在光学显微镜下观察心肌组织中HDAC3表达状况，并拍照记录。使用ImageProPhIS6.0软件对心肌组织中HDAC3阳性区域进行定量。1.7 马松染色将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗后，使用苏木素染液浸染5分钟，中性盐酸酒精溶液分化5秒，自来水流水冲洗10分钟。随后，使用丽春红酸性品红溶液染色4分钟后，迅速用蒸储水漂洗3次。使用磷铝酸水溶液孵育3分钟，苯胺蓝染色5分钟，1%冰醋酸孵育1分钟。蒸镭水漂洗后，
