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1、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒说明书微法100T/96S注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。澜定意义:GSH-PX是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-PX不仅能够特异地催化还原型谷胱廿肽与ROS反应,生成氧化型谷胱廿肽GSSG,从而保护生物膜免受ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。渊定原理:GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH,产生GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化NADPH还原GSSG,再生GSH,同时NADPH氧化生成NAD产;NA
2、DPH在34Onm有特征吸收峰,而NADP+没有;通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。自备仪器和用品:低温离心机、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、96孔板、和蒸储水。试剂组成和配置:试剂一:液体12OmLXl瓶,室温保存。试剂二:粉剂Xl瓶,4tC保存。试剂三:液体10Ll支,2(C保存。试剂四:液体200Lxl瓶,4保存。粗胸液提取:1 .组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:570的比例(建议称取约Slg组织,加入ImL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4C离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌:按照细胞数量(IO4个):试剂一体积(mL)为500
3、1000:1的比例(建议500万细胞加入ImL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体:直接测定。GSH-PX测定操作:1 .酶标仪预热30min,调节波长到340nm。2 .混合试剂在25或者37*C(哺乳动物)水浴中预热30min3 .混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一20mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,混匀。(当天用完)4 .试剂四的稀释:吸取21.5L试剂四,加入5mL蒸饱水充分混匀,临用前配制,配制好的试剂当天使用。5.测定管:依次在96孔板中加入20L上清液
4、、160L预热的混合试剂、20L稀释后的试剂四,迅速混匀后于34Onm处测定第30s和第210s的吸光值,分别记为Al和A2。4A测定管=Al-A2。GSH-Px活性计Jt:使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算GSH-Px活力单位定义:定温度中,每mg蛋白每分钟催化InmolNADPH氧化为1个院活单位。GSH-Px(nmol/min/mgprot)=AdV反总xl4(CprxV样)T=1072ACpr(2) .按样本质量计算GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每g样本每分钟催化InmolNADPH氧化为1个醉活单位。GSH-Px(nmol/min/g鲜重)=AdV反总x1
5、()9H(WXV样V样总)T=1072AW(3)按细胞数量计算活性单位定义:一定温度中,每104个细胞每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px(nmolmin104cell)=AdV反总xl04(细胞数量XV样样总)T=1072A细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义:一定温度中,每亳升液体每分钟催化InmOlNADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px(nmolminmL)=AdV反总xl4V样T=1072A:NADPH摩尔消光系数6.22103Lmolcm;d:96孔板光径,0.5cm:V反总:反应体系总体积,200L=2104L;106:1mol=110ftmol:Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);W:样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积,20L=210-2mL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,3min。注意事项:(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;(2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;(3)测定过程操作须迅速;(4)细胞中GSH-Px活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GSH-Px的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。优利科(上海)生命科学有限