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1、2022类固醇生成因子1基因突变及其相关临床表型研究进展(全文)摘要类固醇生成因子(SF-I,NR5Al)是在性腺及肾上腺发育过程中起关键调控作用的转录因子。NR5A1基因突变是性发育异常(disordersofsexdevelopment,DSD)常见病因之一，目前临床报道的病例多为杂合突变。该基因突变患者临床表型复杂，早期报道的患者表现为不同程度的46,XY性腺发育不良，近年发现该基因突变与男性无精症或女性的卵巢早衰有关，多数患者无肾上腺皮质功能不全。目前认为患者临床表型异质性，可能与不同基因突变对转录活性的功能影响、下游靶基因(如SOX9等)基因剂量效应以及寡基因突变等的遗传背景等相关。
2、通过对NR5A1突变的基因型和相关表型开展研究，有助于人们深入理解性腺发育的过程及其调控机制。一、NR5Al分子结构特征类固醇生成因子-1,也称核受体亚家族5中的A组成员I(SterOidogeniCfactor-1/nuclearreceptorsubfamily5groupAmember1,即SFl,NR5AlAd4BP),是一种孤儿核受体。由位于染色体9q33.3上的NR5A1基因所编码，该基因包含7个外显子，其中6个有编码功能。该基因编码的核受体含有461个氨基酸，其蛋白结构是由含有2个锌指结构的DNA结合域(DBD)、A盒(A-box)、柔性较链区、配体结合区(LBD)及两个激活功能
3、域AF-I和AF-2构成1,2。DNA结合域是NR5A1结构中最保守的区域，第一个锌指结构包含P盒(P-box),可特异性识别靶基因的DNA结合位点，A-box在结合过程中起稳定作用，较链区及AF-2参与转录激活3,4。NR5A1在性腺、肾上腺、脾脏、下丘脑腹内侧核及垂体中广泛表达,是肾上腺及性腺发生过程中的关键转录因子，参与调控类固醇激素生成及，性腺发育过程中相关基因的激活1,5,6,刀。二、NR5A1的功能与其主要下游靶基因的调控人胚胎期性腺发育主要包括两个阶段，第一个阶段是双向潜能性腺的出现,人胚胎约第4周，生殖崎内面的体腔上皮细胞增殖隆起，此时原始生殖细胞迁移到该部位，形成双向分化潜能
4、性腺8。第二个阶段是双向潜能性腺分化为睾丸或卵巢的过程，若为XY胚胎，则NR5A1将维持其在双向潜能性腺中的表达，继而在GATA4、WTl等多个转录因子的协同下使SRY基因的表达升高,当SRY表达到临界阈值时,与NR5A1相互协同，作用于位于SOX9(SRY-relatedHMGboxgene)基因上游13kb处的睾丸特异性增强子核心元件(TESCo),上调并维持了S0X9基因的表达,而S0X9的表达对于促进及维持支持细胞(SertoliCeIl5。分化至关重要9,：L(U1,在睾丸支持细胞中，NR5A1的主要的下游靶基因是缪勒管抑制因子(anti-Mullerianhormone,AMH),
5、通过激活AMH基因的表达，促进合成分泌缪勒管抑制因子，后者作用于副中肾管结构(即缪勒管结构，MuIleianduct),使其退化，因而阻止了46,XY胚胎中子宫、输卵管、阴道上1/3结构的发育5,12;而在睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)中，NR5A1通过调控类固醇生成酶基因的表达，如类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)x细胞色素P450类固醇羟化酶类，促进了以睾酮为主的雄激素分泌，从而诱导中肾管(Wolffianduct)分化成精囊、附睾和输精管,促进外生殖器男性化及睾丸的下降13。在胚胎期卵巢的发育过程中，FO
6、XL2(forkheadboxL2)通过直接与NR5A1近端启动子结合抑制其表达，抑制睾丸组织的发育。然而，在出生后成熟卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞中NR5Al表达却表现为增加。在颗粒细胞中,NR5A1通过与F0XL2相互作用，与其下游靶基因AMH启动子区域结合，上调其表达，而AMH对于促进卵泡发育和和维持卵巢储备功能至关重要2,14,15;在卵泡膜细胞中,NR5A1可上调StAR、芳香化酶(P450aromatase,CYP19A1).17-羟化酶/17,20-裂解酶Q7-hydroxylase/17,20-lyaseenzyme,CYPI7A1)基因的表达，促进类固醇激素的合成及卵泡的发育16
7、,17。NR5A1主要以单体形式结合DNA,通过识别靶基因启动子中含PyCAAGGTCA的DNA序列来调控睾丸、卵巢及肾上腺皮质类固醇激素相关基因的转录活性，包括StAK胆固醇侧链裂解酶(P450Cholesterolside-chaincleavage,CYP11A11).30-羟类固醇脱氢酶(3-hydroxysteroiddehydrogenase,HSD3B1)xII-羟化酶(Il-hydroxylase,CYP11B1),CYP17Alx21-羟化酶(21-hydroxylase,CYP21A2)x17B-羟类固醇脱氢酶3(17-hydroxysteroiddehydrogenase
8、s3,17-HSD3)xCYP19A1等4,18。2011年,SChimmer等19为了探究NR5A1基因对类固醇生成功能的影响，在Yl小鼠肾上腺皮质肿瘤细胞中，用ShRNA敲减NR5A1的表达,发现MC2R(melanocortin2receptor,ACTHR)的转录水平降低最为显著，而CYPllBLStARsHSD3B1、SCARBl的转录水平分别较野生型降低了30%90%以上，类固醇生成水平也大大降低，而当NR5A1表达恢复后以上靶基因的转录水平和类固醇生成量也出现了逆转。然而,CYP11A1的转录水平并未受到NR5A1敲除的影响，提示了不同靶基因的转录对NR5A1表达的依赖程度不同。
9、三、NR5Al敲除的动物模型研究在动物模型的研究中，Luo等通过靶向破坏编码小鼠SF-I的Ftz-Fl基因,发现Ftz-Fl基因纯合缺失的小鼠在出生后8天内死亡，并且出现肾上腺、性腺缺如，皮质酮分泌不足，而外源性补充肾上腺皮质激素可延长其生存时间，表明SF-I在肾上腺皮质的发育中起重要作用，其纯合突变会导致严重的肾上腺皮质功能不全。然而，杂合突变的小鼠往往仅有性腺发育不良但无肾上腺缺失，提示SF-I可能以剂量依赖的方式影响肾上腺和性腺的发育。有趣的是，Bland等20通过建立NR5A1敲除的杂合小鼠模型，发现虽然在静息状态下杂合子小鼠并无肾上腺功能不全的表现，但相较于野生型小鼠，杂合子小鼠的肾
10、上腺及性腺体积明显缩小，并且在应激诱导下皮质酮合成严重受损，无法维持正常代谢，这可能是由于NR5A1单倍剂量不足干扰了肾上腺发育，从而导致应激反应受损，提示NR5A1的正常基因剂量是获得足够应激反应所必需的。Karpova等21采用酵母人工染色体(yeastartificialchromo-some,YAC)Ko小鼠的基础上建立了转基因(SF-I-/；tg/+)小鼠，发现转基因雄性小鼠睾丸中出现精子发育停滞和隐睾等雄性化不足表现，胚胎期间质细胞发育延迟，而出生后小鼠的成年间质细胞发育被完全阻断，与其功能有关的转硫基酶(SUlfotranSferase,SULTlEl)和血管细胞黏附分子(vas
11、cularcelladhesionmolecule1,VCAMl)等基因表达显著降低，提示NR5A1的剂量与功能不足导致的间质细胞发育缺陷与雄性化不全表型相关。此外，Fatchiyah等22采用细菌人工染色体(bacterialartificialChromsomeslBAC)在KO小鼠的基础上采用双启动子和Tet-Off系统建立了转基因小鼠。发现这种转基因的“回补”在胚胎中成功恢复了脾脏的体积。然而,这种转基因的小鼠并没有获得存活的幼鼠，且CYP21A1和3-HSD标记基因在肾上腺原基中均无表达,说明肾上腺发育存在严重缺陷，提示不同的NR5A1的基因剂量，对于不同靶组织的发育，其影响水平有所
12、不同。四、NR5Al的突变功能域分布及剂量效应据报道,目前共发现了238例NR5A1突变，包括188种突变类型，其中90%患者的染色体核型为46zXY;这些突变广泛分布于各功能域，主要以DBD(35%)和LBD(42.3%)功能域为主。NR5A1突变类型多样，包括109种错义突变(58%),45种小片段缺失和插入(24%)导致的10个框内突变和35个移码突变，22种无义突变(12.3%),8个内含子变异(3.3%),4个终止密码突变(1%)。在所有突变类型中，大多是杂合突变，只有约3%为纯合突变23。FABBRl-SCALLET等23认为NR5A1基因突变的遗传模式既不是典型的常染色体隐性遗传
13、，也不是常染色体显性遗传，而是以剂量依赖的方式起作用。Achermann等24描述了第1例NR5A1基因3号外显子DNA结合域P-box中p.G35E杂合突变导致46,XY完全性性腺发育不良的患者，该患者睾丸严重退化，外生殖器呈完全女性型，且伴有肾上腺功能不全，功能研究证实该突变严重损害了NR5A1下游靶基因CYP11A1的转录活性。随后，该研究团队又报道了1例类似表型的女婴，在NR5A1基因A-box区域中发现p.R92Q纯合突变，而其父母与妹妹均为该突变的杂合子，但却有正常的生殖及肾上腺功能，进一步功能研究发现此种纯合突变体转录活性及DNA结合能力的丧失不及P-box突变严重25。以上的病
14、例研究揭示了NR5A1基因以剂量依赖的方式在人类性腺及肾上腺发育过程中起作用，并且不同位点的突变产生的基因剂量效应有所差异。此后的研究发现，在46,XY部分性腺发育不全和男性化不足但肾上腺功能正常的患者中也存在NR5A1杂合突变，这些突变形式包括无义突变、移码突变和错义突变等，常见的表型为轻度性腺发育不良、外生殖器男性化不足而无肾上腺功能不全13,26,27。这些数据都表明了大多数人类NR5A1突变仅影响性腺发育而很少累及肾上腺，似乎相比于肾上腺,性腺发育对NR5A1基因剂量的敏感性更高28。五、NR5Al缺陷相关的临床表型在染色体核型为46,XY个体中,与NR5A1突变相关的临床表型谱很广，
15、从完全性性腺发育不良到外生殖器不同程度男性化(小阴茎、隐睾、尿道下裂等)以及男性不育而无外生殖器发育异常1。在染色体核型为46.XX个体中，NR5A1突变与46,XX睾丸型/卵睾丸型DSD(46,XXtesticularDSD/ovotesticularDSD,TDSD/OTDSD)和原发性卵巢功能不全(primaryovarianinsufficiency,Pol)相关。而无论是在46,XY还是46,XX个体中，肾上腺功能不全(adrenalinsufficiency)均有报道29。1.肾上腺功能不全：根据目前的报道，在人类发育中NR5A1突变引起严重肾上腺功能不全的仅有6例，其突变位点包括
16、p.G35E、p.G35D和p.R255L的杂合突变，p.Glu7*和p.T296M复合杂合突变以及2例p.R92Q纯合突变，分布在NR5A1分子的各个功能域。其中，p.Glu7*和p.T296M复合杂合突变的患者伴有46,XY部分型性腺发育不良,p.G35Rp.R92Q.p.G35D这3例突变的患者伴有46,XY完全性性腺发育不良，而另外2例46,XX的患者仅有孤立的肾上腺功能不全23,30,31。上述突变使类固醇激素合成受阻最终导致肾上腺功能不全，患者均在出生后出现不同程度生长发育迟缓，体重降低、频繁呕吐，皮肤色素沉着等，实验室检查显示血钾升高、血钠降氐、ACTH及肾素活性升高、血浆或尿液中皮质醇、醛固酮含量降低；而单纯糖皮质激素或盐皮质激素不足少见，在使用氢化可的松和氟可的松激素替代治疗后有明显好转25,31,32,33,34。在中国广州单中心的回顾性研究中发现，非先天性肾上腺增生
