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1、胶体金免疫标记技术培训班技术资料一、胶体金的制备根据不同的制备方法，可以制备出直径150Onm的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在3-3Onm范围内。在氯化金（HAlICk）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍, 数量减少为原来的l8o以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径316nm的胶体金。因 此一般胶体金探针
2、均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.10.2%的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂，可以制备12150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备1216nm直径 的胶体金。除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿，故般均
3、以小剂量密封保存（0.5g或1g）,因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20C）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1 %双氯硅烷/氯仿浸泡1小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长，可4保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。K单宁酸/柠檬酸钠法制备316nm胶体金（
4、1）取一 25Oml三角瓶，加入79 ml双蒸水和ImI 1 %氯化金，预热至6070。（2）取一 50 ml烧杯，加入4 mil%柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不 同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至6070C K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对PH的影响不大，K2CO3 可以省略。（3）将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。柠檬酸钠(ml)单宁酸(l)胶体金(nm)450003420004450064120847010410162、白磷还原法制备5 nm胶体金 取250 ml三角瓶一个，加
5、79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3将 溶液调至中性(pH7.0)(2)取0.2 ml饱和磷/乙醯溶液加到L5 ml试管中,再加0.8 ml乙醛，混匀。取0.7 ml 加入溶液(1)中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CUSo4进行中 和)。(3)室温下轻轻摇匀15 min,然后加热沸腾并保持5 min,自然冷却。3、柠檬酸三钠法制备12-3Onm胶体金(FrenS, 1973)(1)取25OmI三角瓶一个，加IOoml双蒸水及ImI 1%氯化金，加热沸腾；(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30 min,溶液颜色首 先变黑，再
6、逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则 颜色偏向紫色。20r15105 (一UJ) srco柠檬酸钠(ml)胶体金(nm)5124163242.83020406080Sol diameter (nm)注意:（1）由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大 小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太 大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。（2）胶体金溶液最好保存在4C冰箱中：也可保存在室温卜.，一般可保存12个月。但决不可保存 在OC以下，否则金粒子发生凝聚。二、蛋白-金复合体的制备一
7、般认为胶体金粒子表面为一层AUCI2,因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒 子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来 电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于PH值，这是因蛋 白的净电荷取决于溶液的PH值，在PH=PI时为中性。由于在PH=Pl时蛋白溶解度最小， 因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备 中，一般胶体金调整为PH=PI+0.5,这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓 度的盐
8、分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用 低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋 白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定 量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30kD）,形成的蛋白复合体往 往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是己知 蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA,牛血清蛋 白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探
9、针。当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳PH值。对于理化性质不 确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同PH值得胶体金结合后，只有某一特定PH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaQ）作用下不会凝聚。不同蛋白的 适宜PH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜PH值为最佳PH值。但有些探针的实际 情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。在确定最佳PH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。 如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚， 并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容
10、易抢先与标记位点结合，起到“封闭” （Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况 下要特别注意。这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同i蛋白结合时，除了蛋白量完全 不同外，往往最佳PH也有一定变化。因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。1、抗血清的前处理一般抗血清中IgG的含量为10-25%,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探 针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在 实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实 验室在蛋白纯化方面有很强
11、的技术支持，高度纯化后效果会更好。大量工作表明，只用硫酸钱沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步 骤如下：(1)取抗血清0.2 ml；(2)加生理盐水(0.85% NaCD 0.3 ml,混匀；(3)逐滴加入饱和(NH4)2S45ml,充分振荡混匀，4静置1 h；(4) IoooorPmmin 离心 20 min,弃上清;(5)加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；(6)逐滴加0.25 ml饱和(NH4)2SO4,充分振荡混匀,4静置1 h；(7) 10000 mmin 离心 20 min,弃上清；(8)重复58步骤一次；(9)加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；(IO)生理盐水中
12、透析12-24 h；(11)在0.2 M PH 9.0硼酸缓冲液透析1224 h；(12)分装，即将使用时4C保存，备用-20C保存。为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4C下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生 理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探 针。2、亲和纯化抗体的处理亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人 的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有 较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。其基本步骤如下：(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为
13、05-l mg/ml浓度(8) 3 M KCNS (硫氟酸钾)溶液中透析12 h(3)在2 mMol pH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h (更换透析液数次)(4)分装备用其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的PH值应与交联时PH值一致。 在实际运用中，一般省略去3M KCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖 蛋白时。我们建议在制备通用探针(如二抗IgG, Protein A, Protein G Streptavidin)等时， 严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。3、IgGFab片段的制备一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于
14、胶体金颗粒较小时 有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的 蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。IgG分子量为15OkD左右，由4个亚基组成，即两条重链(H)和两条轻链(L)。用 水解酸(木瓜蛋白酶)水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原识别活 性的部分，回收后制备探针。Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合。但这种分离只 能在有条件的实验室进行。其基本过程如下：(1)用PBS (pH 7.0,含IomMEDTA, 20mM盐酸半胱氨酸)溶解纯化的IgG(2)加固化木瓜蛋白酹(9) 37处理 5h(4
15、)离心，去除固化木瓜蛋白酷(沉淀)(5)过 Protein G 柱(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理注：Fab与胶体金结合的PH值为6.54、蛋白与胶体金结合最佳PH测定(例纤维素酶，pl未知)(1)取若干个1.5ml试管，分别加入I ml IOnm胶体金； 用 25mMK2CO3将 PH 分别调为 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10； 取一 96孔培养板，按PH从低到高分别将上述胶体金分别取100 l加入孔中，重 复三次；(4)每孔分别加入3l浓度为lmgml的纤维素酶，混合，室温下放置10/5 min；(5)每孔分别加入20 l浓度为10% NaCl溶液,混合，室温下放置IOmin；(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低PH(X)；(7)重复-(5)步,PH 梯度为 X-0.6； X-0.3； X； X+0.3； X+0.6； X+k(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。注意：(10) 体金粒子直径较小(36nm),加NaCl需放置较长时间(几个甚至十几个小时后才能观 察到颜色变化。必要时可放大反应体积(Iml胶体金)，并借助离心来判断。(11) 蛋白最佳PH范
