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1、裸花紫珠提取物诱导L1210细胞凋亡作用的研究林海易博2(1、海南省妇女儿童医学中心2、解放军928医院).摘要：目的：探讨裸花紫珠(CalliCarPanUdifIOra)体外抗白血病作用及机制，提供裸花紫珠的开发利用的理论依据。方法：第一步用乙醇对裸花紫珠进行提取得到再提物(EtOH-extract),第二步用大孔吸附树脂处理EtOH-extract得到终产物：乙醇洗脱物(EtOH-elution)和水洗脱物(EtH2elution)o实脸分：高、中、低3个剂量组，由(EtOH-elution)和(EtH20-elution)分别配制而成。实险组和对照组L1210细胞培养后，用MTT染色，
2、测定吸光度值计算得到生长抑制率。EtOH-elution.EtH20-elution诱导L1210细胞凋亡作用采用台盼蓝拒染法及Hoechst33258/PI双染色，激光共聚焦显微镜观察。结果：EtOH-elUtion、EtHzO-ClUtiOn能明显地抑制L1210细胞增殖，并能诱导细胞凋亡。结论：诱导肿瘤细胞凋亡是裸花紫珠抗肿瘤作用的重要机制之一。关键词：裸花紫珠：提取物：L1210细胞；湖亡中图分类号：文献标识码：A文章编号：InductiveeffectofCallicarpanudifloraonL1210cellapoptosisHaiLIN,YlBo(DepartmentofPh
3、amuicytNo187HospitalofPLA,Haikou571159,China)AbstractzAIM:Toexploretheanti-leukemiaeffectandmechanismofCallicarpanudiflorainvitro,andprovideatheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofCallicarpanudiflora.Method:ThefirststepistoextracttheEtOH-extractwithethanolfromCallicarpanudiflora,andtheseco
4、ndstepistotreatEtOH-extractwithamacroporousresintoobtainthefinalproduct:Ethanoleluate(EtOH-elution)andWatereluate(EtHiO-eluiion).Experimentalgrouping:high,medium,andlowdosegroups,whicharemadeupofEtOH-elutionandEtH2O-elution.ThegrowthinhibitoryeffectofmouselymphocyticleukemiaL1210cellswasdeteninedbyM
5、TTmethod.TheeffectsofEtOH-elutionandEtH2O-elutiononL1210cellapoptosiswereobservedbylaserconfocalmicroscopewithtrj,panblueexclusionmethodandHoechst33258/PIdoublestaining.Results:EtOH-elutionandEtH2O-elutioncansignificantlyinhibittheproliferationandinduceapoptosisofL1210cells.Conclusion:Inducingtumorc
6、ellapoptosisisoneoftheimportantmechanismsofCallicarpanudiflora,santi-tumoreffect.Kywords:Callicarpanudiflora;L1210cellLine;EtOH-elution;EtH2O-elution;inductionofdpoptosisChinese：Documentcode:AArticleID:裸花紫珠(CalliCarPanUdifIOraHoOk)属于马鞭草科紫珠属，又称为止血草，紫珠草等。在海南，广东，广西等省区都有生长，具有很高的药用价值，是海南地道的植物药。裸花紫珠具有多种药用
7、价值，在治疗化脓性炎症,妇科疾病，呼吸道和胃肠道出血,外伤出血基金项目海南省中药现代化专项基金(zy201328);作者简介：1、林海(1974),男，贵州贵阳人，硕士研究生,主要从事肿瘤发病机制及药物干预方面的研究。电话：，E-MAIL：.2、通讯作者：易博，副主任药师，主要研究中药现代化及医院药学，Tel:(0898),Fax(0898),Emil:.等方面都有很好的疗效3L,随着南药的开发利用，野生裸花紫珠资源逐渐减少，为满足药用需求进行人工培植。海南有许多大型栽培和种植基地，特别五指山种植的裸花紫珠最优质。裸花紫珠主要是以地面部分干燥后入药叫主要的药用活性成分为苯丙素类、黄酮类、三菇类
8、、二菇类等网。有报道，裸花紫珠具有抗癌活性，乙醇提取物对慢性白血病骨髓瘤K562细胞具有抑制作用“叫不过，抗癌活性的机理研究较少。本文通过对（EtHzO-elution）和（ElOH-elution）诱导L1210细胞凋亡作用的观察，旨在探寻裸花紫珠抗癌作用的机制。1 .仪器与试药1.1 细胞株：小鼠源淋巴白血病L1210细胞株（购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心）。1.2 试药：裸花紫珠：产于海南五指山，取其地面整株风干，经深圳市中科院仙湖植物园鉴定合格后留用；HP-20大孔吸附树脂：三菱化学集团制造。1.3 样品制备：乙醇提取物（浸膏）：称取LO千克风干留存的裸花紫珠进行粉碎，加入乙
9、醇（70%）70C水浴中回流提取1小时。共提取3次，并后提取液，过滤。滤液用旋转蒸发器减压浓缩,去掉大部分的乙醇和水，得到乙醇提取物（EtOH-extract125.0克，浸膏状物）。终产物EtH20-elution和EtOH-elution（浸膏）制备：取80.0克EtoH-extract浸膏，用蒸储水溶解后大孔吸附树脂柱处理，依次用3倍柱体积水和95%乙醇进行洗脱，减压浓缩（旋转蒸发器中），得到终产物：Et0-elution浸膏28.0克和EtoH-elution浸育48.0克，冰箱中冷冻干燥保存。试液配置：试验前一次性取10.Og终产物溶解于DMSO-第麻油（1:1比例）中，配成0.5g
10、ml的储备液。每个药物浓度组由储备液加入不同体积的0.5%CMC-Na进行稀释得到。2 .方法与结果2.1 细胞培养RPMlI640培养液：含10%灭活（56C,30min）小牛血清、NaHC032.0gL青霉素100UmL1链霉素100UmL,o从液氮罐中取出保存的L1210细胞,解冻,加入RPMII640培养液中，培养箱内保持37、5%C02条件下进行培养。2.2药物对L1210细胞增殖抑制作用在培养箱内将L1210细胞于培养至对数生长期，取出细胞，加培养液配制为IXlo个mL的细胞悬液，用加样枪加样，每孔取200HL细胞液，接种于96孔板。实验分组：空白对照组：加培养液20uL；溶剂对照
11、组：加入溶剂20HL（DMSO-毒麻油+0.5%CMC-Na）：实验组：分高、中、低浓度三组药物：EtOH-elution:25mgmLl,50mgmL1,100mgmL,;EtHaO-elution：25mgmL,50mgmLl,100mgmL1o每个药物浓度设定3复管，加药液20uL各组在相同条件下于培养箱内同时培养24、48、72h,加Mn（浓度为5mgmL1）入96孔板，每孔20UL,继续培养4h,取出，倾入小离心管，以IOoonnP离心5分钟，上清液弃掉，沉淀中加150ULDMSO,吹打震荡使结晶充分溶解（约IOnIin）,将酶标仪波长调整至550nm,测定每孔的OD值。结果取3复管
12、平均值计算:抑制率=（I-OD药/0D对）D100%。MTT测定结果显示:EtH20-elution和EtOH-elution对L1210细胞增殖抑制作用呈时间-剂量依赖性。（表1）表LEtH20-elution和EtOH-elution对L1210细胞增殖抑制HionofL1210growthbydrgs药物剂量_(mgL1)细胞增殖抑制（%）24h48h72h对照组0.002.130.002.150.001.97EtOH-elution253.641.647.571.5211.202.455017.702.31*22.924.05*20.742.1T10029.013.5735.92+5.
13、53”44.895.81EtH2O-elution252.192.138.102.554.54+1.195013.87+3.04*18.123.95*10.673.56*10025.184.Ir30.065.2629.754.19”注：切0.05,*p50mgmL,100mgmL-1；EtHaO-elution：25mgmLl,50mgmLl,100mgInLL步骤：接种好的24孔板于培养箱内培养12、24、48、72h（4个时相点），加入Hoechst33258（终浓度为lugml?）,孵育10min（37避光）。PBS冲洗，离心，弃上清，除去HoeChSt33258。加入Pl染液（浓度为1
14、:2.5）,染色15min（4避光）。PBS冲洗，离心，弃上清，除去Ph取细胞沉淀，涂片，在激光共聚焦显微镜下观察（波长352nm和488nm）o凋亡率册）=100个细胞中的凋亡细胞数。结果：Hoechst33258和PI都是DNA染料。其中Hoechst33258为水溶性，能够大量进入凋亡细胞，在352nm波长下激发蓝色荧光；而Pl染料能够大量进入死亡细胞，在488nm波长下激发红色荧光。因此，激光共聚焦显微镜下，凋亡细胞呈强烈的蓝色，死亡细胞呈强烈的荧光，而正常细胞对两种染料摄取量都少，故呈现低蓝色。EtH0-elution和EtOH-elution都能诱导L1210细胞凋亡，凋亡率与药物作用呈时间-剂量依赖性。（表2、图1、图2、图3、图4、图5）表2.Hoechst33258/PI双染色，激光共聚焦观察细胞凋亡情况Tab-2.Th
