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1、胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和胡萝卜愈伤组织再分化的诱导 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法和相关操作。和相关操作。通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培养技术生产有用次生代谢物这一个技术的养技术生产有用次生代谢物这一个技术的主要流程，技术体系和注意事项。主要流程，技术体系和注意事项。学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和方法。方法。一、实验目的一、实验目的 胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂，胡萝卜愈伤组织经
2、过多次继代，在细胞分裂，细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以诱导疏松性愈伤组织的产生。诱导疏松性愈伤组织的产生。利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块，利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块，可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养体系，并在此基础之上进行培养物的继代和体系，并在此基础之上进行培养物的继代和保持，进行有用次生代谢物的生产。保持，进行有用次生代谢物的生产。二、实验原理二、实验原理植物细胞的悬浮培养植物细胞的悬浮培养由固体培养转向液体培
3、养，对细胞而言有什么差别？细胞悬浮培养的目的和所需要的条件？一个好的培养体系具备什么样的特征？愈伤组织再分化的诱导愈伤组织再分化的诱导培养基：MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L 培养条件：？三三 实验操作实验操作1.1.悬浮培养体系的建立悬浮培养体系的建立 愈伤诱导愈伤诱导外植体外植体 愈伤继代愈伤继代单细胞或细胞细胞团块的获得单细胞或细胞细胞团块的获得液体培养液体培养无菌无菌 脱分化脱分化细胞分裂、细胞分裂、分化调节分化调节方法（机方法（机械和酶法）械和酶法）细胞活力细胞活力细胞分裂和生长细胞分裂和生长分化和代谢调节分化和代谢调节培养基：培养基：MS+2，4-D 0.5m
4、g/L+KT 0.5mg/L做今天实验之前做今天实验之前:前面实验的观察和数据收集前面实验的观察和数据收集-胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反应的观察应的观察 植物细胞工程实验部分实验报告的植物细胞工程实验部分实验报告的撰写撰写生长反应 观察观察 拍照拍照 分析分析有污染有污染无污染无污染污染源污染源:细菌细菌,霉菌霉菌?现象现象?原因原因:外植体外植体?环境环境?操作操作?不生长不生长,发白或死亡发白或死亡愈伤形成愈伤形成不生长不生长,不死亡不死亡,也无愈伤形成也无愈伤形成发生部位发生部位颜色质地颜色质地差异原因差异原因?实实验验报报告告形式形式内容内容文字文字图片图片
5、数据数据分析讨论分析讨论综合性的一篇论文综合性的一篇论文分开的三次实验报告分开的三次实验报告不同污染源导致的污染不同污染源导致的污染不同生长情况的图片不同生长情况的图片不同愈伤组织的图片不同愈伤组织的图片结构上的完整性结构上的完整性术语的正确使用术语的正确使用存活率存活率污染率污染率污染原因的分析污染原因的分析实验结果的分析实验结果的分析思考和讨论思考和讨论具体操作：8人/组 2瓶悬浮培养基/组 约1g 细胞/瓶选择疏松性愈伤组织选择疏松性愈伤组织称重称重,计算细胞鲜重的增加计算细胞鲜重的增加(?g)无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开接种入已预
6、先称重的液体培养基接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重接种后再次称重,获得细胞的鲜重获得细胞的鲜重(1g 左右左右)单细胞或小细胞团块单细胞或小细胞团块悬浮振荡培养悬浮振荡培养1周或更长周或更长收集细胞收集细胞,分离分离-提取提取-纯化胡萝卜素纯化胡萝卜素,并测定含量并测定含量1.悬浮培养2.再分化诱再分化诱导导 8人人/组组 2-3瓶瓶/人人建立起来的无菌培养物建立起来的无菌培养物无菌条件下切割分开无菌条件下切割分开接种在分化培养基上接种在分化培养基上适当条件下培养适当条件下培养1-3周周培养反应的观察培养反应的观察3 胡萝卜素的分离提取和含量测定胡萝卜素的分离提取和含量测定悬浮细胞
7、的收集悬浮细胞的收集甲醇萃取甲醇萃取-胡萝卜素胡萝卜素乙醚纯化乙醚纯化-胡萝卜素胡萝卜素-胡萝卜素胡萝卜素含量的测定含量的测定悬浮细胞的收集悬浮细胞的收集用纱布用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞滤纸过滤培养液收集细胞待溶液完全过滤后称待溶液完全过滤后称纱布纱布/滤滤纸和细胞的重量纸和细胞的重量将细胞转移入圆底烧瓶后再次称将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布纱布/滤纸滤纸重量重量计算细胞鲜重计算细胞鲜重甲醇萃取甲醇萃取-胡萝卜素胡萝卜素每克试样加每克试样加10ml含含10%KOH的甲醇溶液的甲醇溶液水浴上加热水浴上加热(64.8度以上度以上)避光回流避光回流30min将收集好的细胞放入圆底烧瓶中将收集好的细胞放入圆底烧瓶中乙醚纯化乙醚纯化去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液上清液（约上清液（约10ml）放入分液漏斗）放入分液漏斗加入加入150ml乙醚振荡摇匀，静止分层乙醚振荡摇匀，静止分层倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，残留物用残留物用4-5ml己烷溶解己烷溶解含量的测定含量的测定 己烷中的己烷中的-胡萝卜素在波长胡萝卜素在波长452nm下的摩尔消光系数下的摩尔消光系数1cm1%=2500，即溶液的即溶液的OD452为为0.25时每时每ml含含-胡萝卜素胡萝卜素1g。在波长在波长452nm下测定吸光值下测定吸光值A452。
