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1、器材准备器材准备斜面斜面4 4支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）支，空气、手指皮肤、细菌分离培养物（上次实验平板）医学微生物学实验综合性实验三v空气细菌学检查结果分析v手指皮肤细菌学检查结果分析空气的细菌学检查空气的细菌学检查组号12345678910CFU/m3 50,000NAT 86N(直径7cm平板）N：平板上的菌落数 A：平板面积(38.5cm2)T：采样时间(15分钟)CFU：colony forming unit 时间(min)15151515151515151515地点菌落形成单位(CFU)WHO推荐的医院各部门空气细菌标准级别级区级区级区cfu/m310200
2、200500适用范围器官移植、心血管、矫形等外科手术室，保护性隔离室，灌注或配制注射液实验室无菌室、手术室、供应室、婴儿室、中心灭菌单位、术后恢复室、早产儿及产房、重症监护病房一般病房、治疗室、放射室、衣帽室、按摩室、盥洗室、手术室浴室我国公共场所空气卫生细菌学标准（GB96639673-1996，GB16153-1996,平皿直径9cm）撞击法cfu/m31000150025004000沉降法个/皿10203040适用范围35星级宾馆、饭店2星级以下宾馆和非星级带空调宾馆、饭店普通饭店、招待所、酒吧、茶座、咖啡厅、图书馆、博物馆、美术馆、飞机客舱音乐厅、影剧院、录像厅（室）、游艺厅、舞厅、理
3、发店、美容院（店）、游泳馆、体育馆、医院候诊室、候机室、旅客列车车厢、轮船客舱、饭馆（餐厅）液体或固体标本菌落总数测定v可将标本作十倍、百倍、千倍、万倍稀释。v分别取1ml注入直径9cm的灭菌平皿内。v倾注46营养琼脂培养基大约15ml，混合均匀。琼脂完全凝固以后，37培养48小时。v选择菌落数在选择菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总之间的平板作为菌落总数测定标准。数测定标准。v将计数得到的菌落数乘以稀释倍数得出cfu/g(ml)。1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤的细菌学检查第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。2人1个营养琼脂平板上:甲、丙常规
4、洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁手指皮肤细菌学检查结果分析第1格为洗手前：第2格为洗手后 常规(甲、丙)洗手方法：标准(乙、丁)洗手方法：第3格为消毒后：第4格空白对照：+?？-医学微生物学实验综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（三）菌落特征观察P11细菌纯培养P10脓汁和粪便标本检验（录像）油镜使用方法（讲解）菌落特征(Colony Characteristics)v大小：大(直径约3mm以上)，中(直径约13mm)，小(直径约1mm以下)。v形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。v边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。v表面：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙
5、、湿润或干燥。v溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不透明)，溶血(菌落周围出现透明环)。v色素：一般为无色或灰白色，特殊色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培养基不着色)和水溶性色素(菌落及培养基均着色)。细菌的溶血现象v根据细菌对血平板中红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型（甲型）溶血（甲型）溶血:产生溶血素，不完全性溶血，在血平板上菌落周围有12mm半透明的草绿色溶血环。（乙型）溶血（乙型）溶血:呈完全性溶血，在血平板上菌落周围有24mm宽，界限分明，无色透明的溶血环。（丙型）溶血（丙型）溶血:不产生溶血素，在血平板上的菌落周围无溶血环。细菌的纯培养 Pure Cultur
6、esv脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。37培养24小时 v粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落颜色是水溶性的，不是细菌本身的颜色，颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红与美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落；菌落直径23mm。致病菌不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，很淡的粉红色，半透明，直径12mm。37培养24小时 紫黑色紫黑色v若培养、放置时间过长或者平板上某个部位细菌比较多、菌落比较密集，大肠杆菌菌落颜色可能会发生改变。因为大
7、肠杆菌利用完乳糖以后，就要利用蛋白质，蛋白质分解大多产生碱性物质，中和了乳糖分解时产生的酸。大肠杆菌菌落可能会由原来的紫黑色变成粉红色，和致病菌颜色一样。v密集或半密集区域的菌落，不一定是单菌落，单菌落，有可能是菌落形成单位（CFU）。由紫黑色变成粉红色由紫黑色变成粉红色37培养3636小时 斜面接种分工v甲普通平板黄色菌落1支斜面 v乙普通平板白色菌落1支斜面 v丙伊红美蓝平板紫黑菌落1支斜面 v丁伊红美蓝平板粉红菌落1支斜面 斜面标记：组号、黄色、白色、紫黑、粉红。选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落。在平皿底部玻璃上，画个大圈选取菌落，得到同组同学认可，才能挑取。画圈选菌
8、落画圈选菌落甲甲黄黄色色接种环套住菌落，轻刮下来，接种斜面。乙乙白白色色接种环套住菌落，轻刮下来，接种斜面。丙丙紫紫黑黑接种环套住菌落，轻刮下来，接种斜面。丁丁粉粉红红接种环套住菌落，轻刮下来，接种斜面。甲甲黄黄色色乙乙白白色色丙丙紫紫黑黑丁丁粉粉红红斜面接种法 Streak Slant Method甲黄色,乙白色。丙紫黑,丁粉红。标记：组号，颜色生物安全警告v接种环接种斜面一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散
9、引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。灭菌 收集平板 灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）高压蒸汽灭菌 洗刷。奥林巴斯 CX21型 生物显微镜使用须知v显微镜是精密光学仪器，请不要让其受到撞击，请小心操作。v在搬运显微镜时，请按右图所示，以双手抓住镜臂孔的两侧，小心搬运。如果拿住载物台和镜筒等部位搬运的话，有可能会造成损坏。开关与调整光强v开或关之前，必须将亮度调整旋钮按箭头相反相反方向转动到最小最小位置位置，以免损坏灯泡。v电源开关拨到 侧为开，拨到侧为关闭。v按箭头方向转动亮度调整旋钮变亮，相反方向转动则变暗。聚焦v从显微
10、镜的侧面观察，按箭头方向转动粗调旋钮，使物镜尽可能接近接近标本。一边看目镜，一边慢慢逆逆箭头方向转动粗调旋钮，使载物台下降下降。v看到标本以后，用微调旋钮来正确对焦。10倍物镜的工作距离工作距离（WD，从物镜到标本的 距离）为10.5mm。油镜的WD为0.13mm。调整聚光镜位置和孔径光阑v用聚光镜上下移动旋钮，将聚光镜转到最上面。v在孔径光阑环上刻有物镜倍率（10倍，100倍等），观察时将与使用物镜相对应的倍率放到正面。转换物镜v旋转物镜转盘，将希望使用的物镜（10倍、100倍）转到标本的上方。100倍浸油物镜使用方法v油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。v旋转物镜转盘，使
11、油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。v如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过12次浸油，排除油内气泡。香柏油折射率香柏油折射率n=1.515n=1.515空气折射率空气折射率n=1.00n=1.00玻璃折射率玻璃折射率n=1.52n=1.52油浸镜的原理光线光线 滴加香柏油可使滴加香柏油可使光线更多进入物镜光线更多进入物镜,避避免光线通过折射率低免光线通过折射率低的空气而散失的空气而散失,以提高以提高物镜的分辨率物镜的分辨率,使物象使物象明亮清晰。明亮清晰。放大倍数：目镜放大倍数：目镜1010倍倍物镜物镜9090或或100100倍倍显微镜油镜的使用P13v10物镜标本位
12、置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源。v油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。v显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。奥林巴斯奥林巴斯 CX21CX21型型 生物显微镜生物显微镜（实验柜内，实验柜内，每人一台）每人一台）注意：只能横放，不得竖放。注意：只能横放，不得竖放。思考题v在微生物学实验中,怎样才能避免杂菌的污染?v
13、空气的卫生标准规定如何?v你的实验结果说明了什么问题?v怎样从医务人员手指上分离和鉴定金黄色葡萄球菌?v菌落特征主要描述哪几方面问题？任何挑选单菌落？医学微生物学实验综合性实验三、一v空气、手指皮肤的细菌学检查结果分析v脓汁和粪便标本中病原菌的检测菌落特征观察P11细菌纯培养P10（纯培养不得超过18小时）油镜使用方法（讲解）脓汁标本检验（录像）肠道致病菌的分离鉴定（录像）常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1和第和第2 2列分别放置接种针列分别放置接种针和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。和接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。实验器材实验器材 整齐有序整齐有序
