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1、蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术Protein Purification Techniques 汤丽霞电子科技大学Textbook and References 教材：教材：蛋白质纯化技术及应用蛋白质纯化技术及应用 陆健 化学工业出版社 参考书目：参考书目：生物化学实验技术生物化学实验技术 何忠效 化学工业出版社生物化学技术原理及应用生物化学技术原理及应用 赵永芳 科学出版社Exams 平时成绩（平时成绩（1010）：出勤）：出勤+作业；作业；期末考试（期末考试（5050）：对已学知识掌握和综合）：对已学知识掌握和综合运用运用能力的考察；能力的考察；实验成绩（实验成绩（4040）：动手能力）：动手
2、能力+实验报告。实验报告。48学时包括：授课（学时包括：授课（16学时）学时）+实验（实验（32学时）学时）OutlineChapter I Protein Isolation 蛋白质分离蛋白质分离 2 学时学时Chapter II Purification Techniques 纯化技术纯化技术 10 学时学时Chapter III Strategies for Special Protein Purification 几类特殊蛋白质纯化策略几类特殊蛋白质纯化策略 4 学时学时Why do protein purification?To gain insight:研究蛋白质研究蛋白质结构与功
3、能结构与功能基础基础 For use in mdicine：Insulin（胰岛素）（胰岛素）Blood Factor VIII(hemophilia)Glucose oxidase and peroxidae(葡萄糖检测）葡萄糖检测）For use in industry:biocatalysisHow to do?Naturalsource Recombinantsource ExpressionSample preparation Chromatographic purification StorageStop?来源前期处理纯化蛋白质分离纯化过程蛋白质分离纯化过程Ammonium sul
4、fate fractionationCellOrganelleHomogenizationMacromoleculeNucleic acidCarbohydrate(Lipid)SizeChargePolarityAffinitySmall moleculeCell DebrisProteinAmino acid,Sugar,Nucleotides,etc Gel filtration,SDS-PAGE,UltrafiltrationIon exchange,Chromatofocusing,Disc-PAGE,Isoelectric focusingReverse phasechromato
5、graphy,HIC,Salting-outAffinitychromatography,HydroxyapatiteJuang RH(2004)BCbasics材料选择与处理粗分级细分级根据需求设定方案Functional studies Mass SpectroscopyAntigen for immunizationStructural studiespgnggmgmoderate80%high 95-99%protein amount required;purity requirement尽量遵循以下原则：尽量遵循以下原则：As few steps as possible（步骤尽量少）
6、As short a time as possible（时间尽量短）Low Temperature:to keep activity（保持活性）Purification is a tough task1、生物材料的组成极其复杂木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶(papain)Purification is a tough task2、目的蛋白含量极微，只达万分之一，几十万分之一甚至百万分之一。蛋白质纯化好比爬山蛋白质纯化好比爬山材料选择及处理材料选择及处理细胞破碎及分离细胞破碎及分离Chapter I：Protein Isolation 1.1 材料选择及处理材料选择及处理 材料的来源：动物、植物和微生物
7、选材的基本原则：有效成分含量高、稳定性好；来源丰富、易保鲜；提取工艺简单、成本低等。材料处理：动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分；植物要先去壳、除脂；微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。材料选取有效成分含量高的部分主要存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中,以未成熟的果实乳汁中含量最高。木瓜蛋白酶体外重组表达诱导表达及纯化获取蛋白的主要来源之一构建表达载体1.2 细胞破碎和提取细胞破碎和提取细胞破碎：The first step in the purification of most proteins is to disrupt tissues and cells in a controll
8、ed fashion.细胞破碎方法细胞破碎方法 研磨法 高速匀浆超声破碎法压榨冻融表面活性剂或脂溶性溶剂酶法机械法化学法生物化学法物理法细胞破碎方法细胞破碎方法 研磨法：一种机械破碎细胞法适用于动物组织，细菌和植物加入石英砂或经液氮处理以提高效率。高速珠磨细胞破碎方法细胞破碎方法 超声破碎法：借助超声波的振动力破碎细胞。适用于微生物材料,破碎效果与菌体浓度、超声频率以及时间有关。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热。细胞破碎方法细胞破碎方法 压榨法：压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。缺点是仪器费用较高。细胞破碎方法细胞破碎方法 化学法：脂溶性溶剂或SDS(十二烷基磺酸钠)等表面活性剂处理
9、细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂。Fractionation（分离）（分离）:Centrifugation is the most widely used procedure to separate the homogenate into different parts,or fractions.离心机离心机固定角转子F=M2r悬浮式转子（水平转子）悬浮式转子（水平转子）沉降系数沉降系数（sedimentation coefficient）沉降系数沉降系数：即生物大分子在离心力场的：即生物大分子在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。生作用下，从静止状态到达极限速度所需要的
10、时间。生物大分子在离心时，其分子量、密度、形状等均对其物大分子在离心时，其分子量、密度、形状等均对其沉降速度有影响。沉降系数就是用来描述此沉降性质沉降速度有影响。沉降系数就是用来描述此沉降性质的。的。生物大分子沉降生物大分子沉降时间时间通常为通常为1 12002001010-13-13秒范围；秒范围；S=10S=10-13-13秒秒Chapter I 小结小结 对蛋白质纯化过程大概了解 细胞破碎方法（重点）沉降系数（理解掌握）补充一：确定目标蛋白检测手段补充一：确定目标蛋白检测手段u Detection and quantitation of targeting proteinu The as
11、say should be:Specific:专一 Quantitative:定量 Economical in terms of time and material：简便经济 补充二：补充二：Buffer preparation(缓冲液配制）缓冲液配制）Buffers are solutions of weak acids or bases and their salt(s),which resist changes in pH.Buffer preparation pKapKa值值:该基团在此该基团在此pHpH一半解离一半解离Henderson-Hasselbalch方程方程pH=pKa+l
12、g 质子受体质子受体 质子供体质子供体 缓冲液有效缓冲范围为PKa1pH以醋酸缓冲液为例（CH3COOH/CH3COONa）Buffer regionQ:Could the required mixture of CH3COOH and CH3COONa be made by titrating a solution of CH3COONa to the correct pH with HCl?Noacid+base=salt+watera buffer=(acid+its salt)or(base+its salt)Q:Could the required mixture of CH3COO
13、H and CH3COONa be made by titrating a solution of CH3COOH with NaOH?Yes!No by product produced(没有副产物生成）没有副产物生成）缓冲液分子量pKa值缓冲范围Tris121.18.087.1-8.9HEPES238.37.477.2-8.2MOPS209.37.156.6-7.8PIPES304.36.766.2-7.3MES195.26.095.4-6.8常用缓冲液的常用缓冲液的pKapKa值值Tris：三羟甲基氨基甲烷；HEPES：n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磷酸；MOPS：3-（n-吗啉代）丙磺
14、酸；PIPES：n，n-双（2-乙磺酸）哌嗪；MES：2-（n-吗啉代）乙磺酸。Add some other components in case they are needed：l 添加必要的稳定剂：巯基的保护剂(DTT,巯基乙醇）l 添加金属离子络合剂：EDTA l 添加蛋白酶抑制剂：l PMSF（苯甲基磺酰氟）-抑制哺乳动物蛋白酶l DFP（磷酸二异丙基辅）-抑制丝氨酸蛋白酶l 蛋白质添加剂：BSA牛血清白蛋白或酪蛋白纯化图表纯化图表3、酶活测定方法 Enzyme assays:Progress curve method（进度曲线法）Enzyme dilution curve Substrate dilution curve4、pH对酶活力的影响 The effect of pH on enzyme activity：
