《蛋白质研究的基本实验方法.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质研究的基本实验方法.ppt（59页珍藏版）》请在第壹文秘上搜索。
1、蛋白质研究的基本实验方法实验研究三个水平n整体水平：动物模型n细胞水平：形态、功能n分子水平：基因、蛋白质蛋白质的调控n基因序列的变化：ErbB2n染色质水平上基因活化的调节：染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加）组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化）组蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C；5端CpG）蛋白质的调控n转录水平的调控 顺式作用元件，反式作用因子（转录因子）n转录后的调控n翻译水平的调控n翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化n定位蛋白质调控的研究nQualitative model(cyclins)nQuantitative model(CDK)
2、蛋白质研究的基本方法n免疫印迹（Western Blot）n免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）n染色质免疫共沉淀（ChIP）Western Blotn免疫印迹（蛋白质印迹）是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。是在凝胶电泳（高分辨率）和固相免疫测定技术（高特异性，高灵敏性）基础上发展而来。Western BlotWestern BlotnA.Sample preparationnB.ElectrophoresisnC.Transfer of proteins and staining(Western blotting)蛋白裂解液的制备n组织样品组织样品：取适量（约10
3、0mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。n细胞样品细胞样品：每份样品取11061107 细胞，PBS 清洗细胞，去PBS，加0.1ml1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。蛋白裂解液的制备蛋白裂解液的制备nRIPA Buffer：裂解液和细胞应充分接触，RIPA buffer足量。RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法测定蛋白浓度。蛋白裂解液的制备n当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活。为了避免这些
4、情况的出现，在样品制备时尽可能在低温下进行。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂。nWestern Blot 临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的 PMSF（苯甲基磺酰氟）。nCo-IP 蛋白酶抑制剂：胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)等；能够强烈抑制所有蛋白酶的活性（如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶）。蛋白裂解液的制备n组织细胞裂解过程中释放大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化。nWestern Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白
5、激酶活性测定，抑制磷酸化蛋白质去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态。nNa3VO4、NaFn蛋白磷酸酶抑制剂蛋白磷酸酶抑制剂：特异性抑制某一种或几种蛋白磷酸酶活性。该混合物优化的组成使其可以强烈几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括蛋白丝/苏氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。蛋白质定量n直接紫外吸收法 含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 280nm附近的紫外吸收峰 测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质干扰 适合于与色谱柱联用，达到实时监控，较不准确n比色测定法蛋白质定量n比色测定法 在典型的蛋白测定中，
6、化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。nBradford法 蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合 最大吸收峰从465nm变为595nm 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比 不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。蛋白质定量nLorry法 蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使肽键伸展，暴露出酪氨酸和色氨酸，在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种
7、蛋白质作标准。Lorry法进行了改良蛋白质定量nBicinchoninic acid(BCA)法 近来广为应用的蛋白定量方法。原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比。灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。蛋白质定量n绘制标准曲线 分别取一定体积的浓度为2mg/ml的标准BSA溶液，加PBS溶液至20ul配成如下浓度梯度的BSA溶液:0m g/ml、0.015625m
8、g/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml。样品(样品BSA溶液或蛋白质溶液)与PBS共25ul（0.1ml）加样，最后每孔均加200ul（2ml）工作液（BCA：Cu 50：1 嫩绿色）混匀，37 C孵育30 min,冷却到室温后，酶标仪上562 nm处读数。Western Blot蛋白免疫印迹（Immunoblotting）n凝胶电泳（SDS-聚丙烯酰胺凝胶）n样品的印迹（蛋白质转移固相支持物：硝酸纤维素膜（NC 膜）和PVDF 膜）n免疫学检测（用特异性的抗体检测所要研究的相应抗
9、原）SDS-PAGESDS-PAGE原理原理n蛋白质中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷。n为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和-巯基乙醇的上样缓冲液。SDS-PAGEnSDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na）：一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。n-巯基乙醇：强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。SDS-PAGEn溴酚蓝染料：用于监控整个电泳过程。n蔗糖或甘油：增大溶液密度，使加样
10、时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。n高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。SDS-PAGEn1xSample buffer:60mM Tris-Cl pH 6.8 2%SDS（心脏，肌肉5%）10%glycerol 0.01%Bromophenol blue 1.5%2-mercaptoethanol SDS-PAGE SampleSDS-PAGEnpH 不连续和胶孔径大小不连续n电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层（孔径大），pH8.8 的分离胶层在下层（孔径小），上槽为负极，下槽为正极。SDS-PAGEnPAG
11、E 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶。SDS-PAGEn在浓缩胶运动中，Cl解离度大，Pro解离度居中，甘aaCOO解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl Pro COO，一个Cl领路，COO推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。n由于胶联度小，孔径大，Pro受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。n当蛋白质进入分离胶时，此时Pro，Cl，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Cl完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。SDS-PAGEn
12、由于Pro在电泳过程中，带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。SDS-PAGESDS-PAGEn催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。n加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。SDS-PAGESDS-PAGEn上样量：总蛋白量 20-50ug（上样量过多使电泳条带变形）n70V，30min；110V，与待分离样品靶蛋白分子量相适应。S
13、DS-PAGE Electrophoresis转膜（电转移）n印迹中常用的固相材料有NC 膜、尼龙膜、PVDF 等。nPVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。n有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。转膜nNC膜及滤纸的预处理：剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中）nPVDF 膜的预处理：剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。转膜n缓冲液通过凝胶时会将蛋白质
14、带到硝酸纤维素（或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。n有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素（或PVDF）膜上。转膜转膜n电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间Western BlotWestern Blotn封闭（2h）：用蛋白溶液（如5的脱脂奶粉或BSA）处理以封闭硝酸纤维素（或PVDF）膜上剩余的疏水结合位点。（先用0.2-0.5%丽春红预染）n一抗（过夜或2h）：只有待研究的蛋
15、白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。（反贴法）Western BlotWestern Blotn二抗（1h）：带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。n最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。eg：辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶Western Blotn检测辣根过氧化物酶的方法n增强化学发光法（ECL；2min）辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（lumin
16、ol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。Western Blot 必需要内参！必需要内参！Western Blotn一、二抗的选择及比例n凝胶质量（气泡，脆）n电转方向，气泡，电流电压，温度nNC Tween200.3%n洗膜免疫共沉淀（co-IP）n免疫沉淀(IP)利用抗原抗体特异性结合的特性，将抗原（靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。n免疫共沉淀(co-IP)在体外探测2个蛋白质分子之间是否存在特异性相互作用的一种方法。免疫共沉淀n原理 如果2个蛋白质分子能够发生特异性相互作用，当用一种蛋白质的抗体进行免疫沉淀，另一个蛋白质也会同时被沉淀下来。抗原-抗体的免疫反应免疫共沉淀n抗体的选择 多克隆抗体：多位点结合，抗原抗体复合物 稳定；广泛，假阳性 单克隆抗体：单一结合特异性，相同靶蛋白 的不同修饰；非特异性少，交 叉反应免疫共沉淀n抗体固定（沉淀）多聚糖凝胶颗粒Sepharose CL-4B 蛋白A或蛋白蛋白G 免疫共沉淀n当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的
