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1、生命科学领域的新工具生命科学领域的新工具SELDISELDI蛋白质芯片蛋白质芯片 20世纪世纪90年代，随着全球基因组计划的推进，人年代，随着全球基因组计划的推进，人类对生命科学的认识达到了新的未有的深度和高度。类对生命科学的认识达到了新的未有的深度和高度。人类基因组工作草图公布后，标志着基因框架已经绘人类基因组工作草图公布后，标志着基因框架已经绘就，人类染色体总就，人类染色体总DNA有有32亿碱基对，包含有亿碱基对，包含有3万个万个左右基因，远远少于原有约左右基因，远远少于原有约10万个基因的估计。但是，万个基因的估计。但是，由于真核生物中基因结构的复杂性及现有基因识别技由于真核生物中基因结
2、构的复杂性及现有基因识别技术发展的严重不足，所以适用范围仅限于原核生物或术发展的严重不足，所以适用范围仅限于原核生物或低等真核生物，此情况进一步表明人类对自身基因组低等真核生物，此情况进一步表明人类对自身基因组的所有基因及其间隔序列还没有完全确定。的所有基因及其间隔序列还没有完全确定。一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世 加之加之mRNA自身在贮存、转运、降解、翻译调空以自身在贮存、转运、降解、翻译调空以及产物的翻译后加工，难以准确地反映基因功能的真正及产物的翻译后加工，难以准确地反映基因功能的真正执行体的质与量。而功能性蛋白质是基因功能
3、的执行体，执行体的质与量。而功能性蛋白质是基因功能的执行体，能直接反应基因给予的信息，后基因时代便接踵而来。能直接反应基因给予的信息，后基因时代便接踵而来。以蛋白质作为研究对象，对正常细胞及变异细胞功能进以蛋白质作为研究对象，对正常细胞及变异细胞功能进行分析，从而可以寻找疾病的特异性标志物；也可以利行分析，从而可以寻找疾病的特异性标志物；也可以利用寻找终末点的方法来对化学制剂和药物毒副作用进行用寻找终末点的方法来对化学制剂和药物毒副作用进行评估。评估。一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世一、蛋白质组学研究的兴起及蛋白质芯片技术的问世 Differential Protein Expr
4、ession蛋白质蛋白质Functional Assays蛋白质功能蛋白质功能基因基因DNA Sequencing信使信使RNADifferential Gene ExpressionDNA/RNAProteinsProteinChip Technology P R O T O M I C SP R O T O M I C SEnabling TechnologyEnabling TechnologyThe phenotype at the molecular levelEnabling TechnologyEnabling TechnologyPCR GeneChip&Microarrays
5、 G E N O M I C SG E N O M I C SThe genotype at the molecular level 美国美国Ciphergen生物公司生产的生物公司生产的SELDI-TOF MS（surface enhanced laser desorprion/ionization-time of flight mass）主要包括三个基本部分：）主要包括三个基本部分：特殊材料制成的固相载体，即蛋白芯片阵列，组特殊材料制成的固相载体，即蛋白芯片阵列，组成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计的，成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计的，概括起来可归纳为两大类型：
6、概括起来可归纳为两大类型：a.化学型材料；化学型材料；b.生物化学生物化学型材料。型材料。二、二、SELDI蛋白质芯片仪的组成及工作原理蛋白质芯片仪的组成及工作原理 蛋白质芯片解读仪（蛋白质芯片解读仪（proteinchip reader），），蛋白蛋白质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线/氮激光光源的解析氮激光光源的解析离子化（离子化（laser desorption ionization，LDI）时间）时间-飞行质飞行质谱仪（谱仪（TOF MS）。基质分子吸收激光能量，样品解吸附，）。基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质基质样品之间发生电荷转移使样品分子电离，
7、经解样品之间发生电荷转移使样品分子电离，经解析析/离子化过程而形成气化离子状态，它们进入离子化过程而形成气化离子状态，它们进入TOF-MS区域飞行。根据蛋白质通过离子室的飞行速度，得出每区域飞行。根据蛋白质通过离子室的飞行速度，得出每个蛋白质的质量个蛋白质的质量/电荷比（电荷比（m/z），其公式为：），其公式为：E1/2mv2ZV；M/ZK*t2（其中（其中Z为电荷数，为电荷数，V为为 电压，电压，v为为飞行速度，飞行速度，K为一常数）。为一常数）。二、二、SELDI蛋白质芯片仪的组成及工作原理蛋白质芯片仪的组成及工作原理N-LaserTOF-MSTOF-MS50007500100001250
8、0500075001000012500Weak cation exchange pH 4.5 wash0510500075001000012500Trace View500075001000012500500075001000012500Weak cation exchange pH 4.5 wash500075001000012500Gel View500075001000012500500075001000012500Weak cation exchange pH 4.5 wash0510500075001000012500Map ViewDetection Using the Prote
9、inChip System 用激光解吸电离发法将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来用激光解吸电离发法将保留在芯片上的蛋白质洗脱下来Retained proteins are“eluted”from the ProteinChip Array by Laser Desorption and Ionization 电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量Ionized proteins are detected and their mass accurately determined by Time-of-Flight Mass Spe
10、ctrometry 蛋白质芯片软件控制分析系统（蛋白质芯片软件控制分析系统（Software）SELDI TOF-MS 控制分析软件，由控制分析软件，由Ciphergen公司研发，软件控制公司研发，软件控制分析系统使整个操作过程变的自动化、简捷化、人性化。目分析系统使整个操作过程变的自动化、简捷化、人性化。目前所用的软件系统为前所用的软件系统为proteinchip software 3.11版本，它主要版本，它主要包括：包括：a.数据库的建立；数据库的建立；b.内部信息及外部信息的校准；内部信息及外部信息的校准；c.数据处理与分析。二维凝胶电泳（数据处理与分析。二维凝胶电泳（2-DE）是经典
11、的蛋白质）是经典的蛋白质分离技术，分离技术，SELDI蛋白质芯片技术对样品的要求以及对样品蛋白质芯片技术对样品的要求以及对样品的处理大大简化的处理大大简化SELDI蛋白质芯片仪最适合分析多肽及蛋白蛋白质芯片仪最适合分析多肽及蛋白质混合物，它是现今灵敏度最高的质谱仪，能够对极微量样质混合物，它是现今灵敏度最高的质谱仪，能够对极微量样品进行分析。品进行分析。二、二、SELDI蛋白质芯片仪的组成及工作原理蛋白质芯片仪的组成及工作原理Protein Discovery and Characterization ProteinChip Advantages蛋白质飞行质谱的技术优势n从未经提纯的生物或临床
12、样品中直接捕获从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获,检测和分析蛋检测和分析蛋白质白质,不需任何标记或加尾不需任何标记或加尾.n超高的检测灵敏度超高的检测灵敏度(1-50 fmole的蛋白质的蛋白质)n从超小样品体积从超小样品体积(0.5 l)到大体积到大体积(400 l)的灵活选用的灵活选用n小型实验或高通量筛选的自由选择小型实验或高通量筛选的自由选择:每次可准备每次可准备8,16,96,or 192 个样品个样品 n快速获取实验结果快速获取实验结果n超精确的蛋白质分子量超精确的蛋白质分子量 在识别特定蛋白质表达物，细胞株肽库的建立，在识别特定蛋白质表达物，细胞株肽库的建立，完成肿瘤生物学标志
13、物的筛选和鉴定，从蛋白质水完成肿瘤生物学标志物的筛选和鉴定，从蛋白质水平上对药物毒性和安全性的评价等方面均证实蛋白平上对药物毒性和安全性的评价等方面均证实蛋白质芯片是一种高通量、高灵敏度、高特意性且微型质芯片是一种高通量、高灵敏度、高特意性且微型化的蛋白质分析系统。化的蛋白质分析系统。三、三、SELDI蛋白质芯片仪在医学中的应用蛋白质芯片仪在医学中的应用 药物靶点的发现和证实 疾病监测(药物疗效的追踪等)毒理学 临床诊断 药物动力学 免疫方法设计与筛选 受体配体反应 蛋白质-蛋白质相互作用 DNA-蛋白质相互作用 纯化策略的设计与纯化过程的监测 蛋白质身份检索 蛋白质修饰分析(磷酸化,糖基化等
14、)抗原决定位点分析蛋白质指纹图谱分析蛋白质指纹图谱分析蛋白质的纯化与分析蛋白质的纯化与分析分子识别分子识别ProteinChip Applications蛋白质飞行质谱的应用 三、三、SELDI蛋白质芯片仪在医学中的应用蛋白质芯片仪在医学中的应用 由于新的蛋白质芯片技术能快速方便地找出痕量存由于新的蛋白质芯片技术能快速方便地找出痕量存在的蛋白质，因此可广泛应用于基础医学研究。在的蛋白质，因此可广泛应用于基础医学研究。Diamord DL等将等将Epstein-Barr病毒基因导入病毒基因导入B细胞内，细胞内，利用利用SELDI蛋白质芯片技术检测蛋白质芯片技术检测B细胞所分泌微量球蛋细胞所分泌微
15、量球蛋白的变化，精确筛选靶细胞进行传代培养，达到预期试白的变化，精确筛选靶细胞进行传代培养，达到预期试验目的。验目的。SELDI蛋白质芯片技术正如基因芯片、组织芯蛋白质芯片技术正如基因芯片、组织芯片等生物芯片为生物信息时代的发展注入了活力。片等生物芯片为生物信息时代的发展注入了活力。1.在基础医学中的应用在基础医学中的应用 Ad是神经系统进行性退变而形成的一种疾病，它是是神经系统进行性退变而形成的一种疾病，它是痴呆性疾病中最常见的一种。痴呆性疾病中最常见的一种。AD突出的特点表现在大脑突出的特点表现在大脑组织中出现退化斑块及神经纤维联系混乱。组织中出现退化斑块及神经纤维联系混乱。Huw Dav
16、ies等等人利用人利用SELDI蛋白质芯片仪对患者脑脊液进行检测，发现蛋白质芯片仪对患者脑脊液进行检测，发现了了-淀粉样蛋白肽（淀粉样蛋白肽（Amyloid peptide，A），可导致人），可导致人脑产生神经系统退行性改变；该研究小组还论证了脑产生神经系统退行性改变；该研究小组还论证了A的差的差异性变体异性变体A1-42对大脑神经细胞的毒性作用。对大脑神经细胞的毒性作用。2.在临床医学中的应用：在临床医学中的应用：老年痴呆症（老年痴呆症（AD）三、三、SELDI蛋白质芯片仪在医学中的应用蛋白质芯片仪在医学中的应用 前列腺癌在西方国家发病率较高，美国前列腺癌的发病前列腺癌在西方国家发病率较高，美国前列腺癌的发病率占男性恶性肿瘤第一位。由于血清中率占男性恶性肿瘤第一位。由于血清中PSA的低特异性，导的低特异性，导致许多假阳性和假阴性的发生，说明致许多假阳性和假阴性的发生，说明PSA作为前列腺癌早期作为前列腺癌早期诊断及前列腺内皮细胞恶变初期的检测指标不甚令人满意，诊断及前列腺内皮细胞恶变初期的检测指标不甚令人满意，GL Wright Jr等人运用等人运用SELDI蛋白质芯片技术不但快速、
