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1、实验一 脑脊液理学检查w（目的）（目的）掌握脑脊液理学检查的内容，掌握脑脊液理学检查的内容，方法。方法。w（标本）（标本）新鲜脑脊液。新鲜脑脊液。w（操作）（操作）w1观察颜色观察颜色 肉眼观察脑脊液颜色变化，肉眼观察脑脊液颜色变化，分别以无色，乳白色，红色，棕色，或分别以无色，乳白色，红色，棕色，或黑色，绿色等文字如实描述报告黑色，绿色等文字如实描述报告。w2观察透明度观察透明度 肉眼观察脑脊液透明度肉眼观察脑脊液透明度变化。正常脑脊液清晰透明，病理情况变化。正常脑脊液清晰透明，病理情况下可出现不同程度浑浊，可分别以下可出现不同程度浑浊，可分别以“清清晰透明晰透明”。“微浑微浑”，“浑浊浑浊
2、”等如实等如实报告。报告。3观察凝块或薄膜观察凝块或薄膜 轻轻倾斜试轻轻倾斜试管，肉眼仔细观察有无凝块或薄膜。正管，肉眼仔细观察有无凝块或薄膜。正常脑脊液无凝块或薄膜，脑膜炎时可形常脑脊液无凝块或薄膜，脑膜炎时可形成凝块或薄膜，分别以成凝块或薄膜，分别以“无凝块无凝块”，“有凝块有凝块”，“有薄膜有薄膜”等如实报告。等如实报告。（注意事项）（注意事项）w 当标本颜色或透明度改变不明显时，当标本颜色或透明度改变不明显时，应在灯光下以白色或黑色为背景仔细观应在灯光下以白色或黑色为背景仔细观察，同时观察有无凝块。察，同时观察有无凝块。w 怀疑为结核性脑膜炎时，标本应在怀疑为结核性脑膜炎时，标本应在2
3、4环境中静置环境中静置1224h再观察脑脊液再观察脑脊液表面有无薄膜形成。表面有无薄膜形成。w参考值参考值：无色，清晰透明，放置后无凝：无色，清晰透明，放置后无凝块或薄膜形成块或薄膜形成。实验二实验二 脑脊液显微镜检查脑脊液显微镜检查w（目的）掌握脑脊液显微镜检查的内容，方法。w（器材）显微镜，改良牛鲍计数板，微量吸管。刻度吸管，小试管。w（试剂）生理盐水或红细胞稀释液，冰乙酸，白细胞稀释液，瑞氏染液或瑞吉染液。w（标本）新鲜脑脊液。w（操作）w细胞总数计数w直接计数法（适用于清晰透明或微浑脑脊液）w充池：微量吸管吸取混匀的脑脊液，充入血细胞计数板的上下2个计数池。w计数：静置23min，低倍
4、镜下计数2个计数池内四角和中央大方格共10个大方格内的细胞数。w计算：10个大方格内的细胞总数即为每微升脑脊液细胞总数，再换算稀释计数法（适用于浑浊的脑脊液）w 稀释：如标本细胞过多，可根据标本内细胞稀释：如标本细胞过多，可根据标本内细胞多少，用生理盐水或红细胞稀释液对标本进多少，用生理盐水或红细胞稀释液对标本进行一定倍数稀释。行一定倍数稀释。w 充池：用微量吸管吸取混匀后的稀释脑脊液充池：用微量吸管吸取混匀后的稀释脑脊液充入充入1个计数池。个计数池。w 计数：静置计数：静置23后，低倍镜计数后，低倍镜计数1个计数池内个计数池内四角和中央大方格共四角和中央大方格共5个大方格内的细胞数。个大方格
5、内的细胞数。w 计算：根据计算：根据5个大方格内细胞总数及稀释倍数，个大方格内细胞总数及稀释倍数，计算每升脑脊液的细胞总数。计算每升脑脊液的细胞总数。白细胞计数w直接计数法（非血性清晰透明或微浑脑脊液）w除去红细胞：在小试管内加入冰乙酸12滴，转动试管，使内壁粘附少许冰乙酸后倾去，滴加混匀的脑脊液34滴，混匀，放置数分钟，使红细胞破坏。w充池：w计数：w计算：稀释计数法（浑浊脑脊液）稀释计数法（浑浊脑脊液）w 稀释破坏红细胞：根据标本内白细胞多少情稀释破坏红细胞：根据标本内白细胞多少情况，用白细胞稀释液对标本进行一定倍数的况，用白细胞稀释液对标本进行一定倍数的稀释，混匀，放置数分钟，破坏红细胞
6、。稀释，混匀，放置数分钟，破坏红细胞。w 充池：用微量吸管吸取混匀稀释后的脑脊液充池：用微量吸管吸取混匀稀释后的脑脊液充入充入1个计数池。个计数池。w 计数：静置计数：静置23min后，低倍镜计数后，低倍镜计数1个计数池个计数池内的四角和中央大方格内的白细胞数。内的四角和中央大方格内的白细胞数。w 计算：根据计算：根据5个大方格内的白细胞总数和稀释个大方格内的白细胞总数和稀释倍数，计算每升脑脊液的白细胞总数倍数，计算每升脑脊液的白细胞总数 白细胞分类计数w 直接分类法 白细胞计数后，转换高倍镜，根据细胞的形态和细胞核形态进行直接分类，共计数100个白细胞（包括内皮细胞），分别计数单（个）核细胞
7、（包括淋巴细胞，单核细胞，内皮细胞）和多（个）核细胞（粒细胞系）的数量，结果以单核细胞百分比和多核细胞百分比报告。如白细胞不足100个，可直接写出单核细胞和多核细胞具体数，若白细胞数不足30个，可不做直接计数而改用涂片染色分类计数w涂片染色分类法 若直接分类不易区别细胞时，可将脑脊液以1000r/min离心5min，取沉淀物，制成均匀薄片，置于室温或37恒温箱内尽快干燥，瑞氏或瑞吉染色后，油镜下进行分类计数，结果报告与血液白细胞分类计数报告方式相同。若见激活型单核细胞（比普通单核细胞大，胞质边缘趁、呈花边状，胞质内有空泡），转化型淋巴细胞（形态似异型淋巴细胞）及室管膜细胞（形态似大淋巴细胞）应
8、计入分类的百分比中（注意事项）（注意事项）w 直接白细胞计数时，也可用微量吸管吸取冰乙酸后尽可能全部吹出，仅使吸管内壁粘附少许冰乙酸，再吸取少量混匀的脑脊液于吸管中，数分钟后吸管内红细胞溶解，然后再充池计数。w 细胞计数时，如发现较多红细胞有皱缩或肿胀等异常现象，应如实报告，以协助临床医生鉴别是陈旧性出血或新鲜出血。w 血性脑脊液中的白细胞必须校正后才有价值w 白细胞校正数=脑脊液白细胞未校正数脑脊液红细胞数血液白细胞数/血液内红细胞数w细胞涂片时，为了使细胞容易粘在玻片上，可取沉淀的细胞悬液2滴，加血清1滴，混匀后涂片。w涂片染色分类时，如见内皮细胞或异常细胞，则另行描述报告，必要时用巴氏或
9、HE染色查找肿瘤细胞。w实验结束后，血细胞计数板用0.75（V/V）乙醇浸泡消毒60min，忌用酚浸泡，以免损坏计数板。方法学评价方法学评价w 脑脊液细胞计数和分类目前一般任用手工显微镜法。白细胞直接分类法简单，快速，但属粗略分类，其准确性差，且细胞较小，初学者难把握，尤其是陈旧性标本的细胞变形，分类更困难，误差较大。涂片染色分类法分类详细，结果准确可靠，尤其是可以发现异常细胞如肿瘤细胞。该法被推荐使用，但其操作较复杂，费时。w 血液分析仪也可进行脑脊液细胞计数和白细胞分类，此法简单，快速，但标本尤其是病理性，陈旧性标本中的组织，细胞的碎片以及细胞变形等都可以影响细胞分类和计数，故结果重复性，
10、可靠性有待进一步探讨。另外，蛋白质含量高，尤其有凝块的脑脊液标本容易使仪器堵孔，故不推荐使用质量控制质量控制w 标本采集后应在1h内进行细胞计数，若放置太久，细胞可能凝集成团或破坏，影响计数结果。标本必须混匀方可充池，否则影响计数结果w因穿刺损伤血管，引起血性脑脊液，白细胞计数结果必须校正，以剔除因出血而带来的白细胞。w细胞计数时应注意新型隐球菌与白细胞，红细胞区别w 白细胞计数直接法的试管或吸管中的冰乙酸要尽量去尽，否则结果偏低。w若标本陈旧，细胞变形时，白细胞直接分类法误差大，推荐用涂片染色分类法分类计数。w涂片染色分类计数时，离心速度不能太快，否则细胞形态受影响，有条件的单位可用玻片离心
11、沉淀法，细胞室沉淀法等收集细胞。w涂片固定时间不能太长，更不能高温固定，以免细胞皱缩。参考值参考值w 脑脊液细胞总数：成人（010）106/L,儿童（015）106/L.w 无红细胞，仅有少数白细胞，以单个核细胞为主，几乎完全为淋巴细胞，偶尔内皮细胞。实验三实验三 脑脊液蛋白质定性检查脑脊液蛋白质定性检查w 目的）掌握脑脊液蛋白质定性试验（潘迪试验）的方法。w（原理）脑脊液中球蛋白与苯酚结合，形成不溶性蛋白盐而产生白色浑浊或沉淀。w（器材）小试管，刻度吸管，尖滴管。w（试剂）饱和苯酚溶液：取苯酚10ml（有结晶时，先放入56水浴箱中加热助溶），加蒸馏水至100ml，充分混匀，置入37温箱中数小
12、时，见底层有苯酚析出，取上层饱和苯酚溶液于棕色瓶中避光保存。w（标本）新鲜脑脊液。w（操作）w1加试剂 取试剂2ml于小试管中。w2加标本 用尖滴管垂直滴加脑脊液标本12滴。w3观察结果 在黑暗背景下立即用肉眼观察结果。w4判断结果w（1）清晰透明，不呈现云雾状为（一）。w（2）呈微白雾状，对光不易看见，黑色背景下才能见到为（+）w（3）灰白色云雾状为（+）。w（4）白色浑浊或白色薄云状沉淀为（+）。w（5）白色絮状沉淀或白色浓云块状为（+）。w（6）立即形成白色凝块为（+）。注意事项注意事项当室温在10以下时，应将试剂保存在37温箱中，否则饱和度降低，可致假阴性。试管内径以小为佳，一般为（13+-1）mm，加入试剂后立即观察结果。标本中如红细胞过多，应离心沉淀取上清液检测质量控制w 标本因穿刺出血，有血清蛋白混入可引起假阳性。w 实验中所用试管和滴管必须洁净，否则易出现假阳性。w 苯酚不纯可引起假阳性。室温低于10，苯酚饱和度降低可引起加阴性。w 人工配置含球蛋白的溶液作阳性对照，可在正常脑脊液或配置与正常脑脊液基本成分相似的基础液中加不同量的球蛋白。w（参考值）阴性或弱阳性。胸腹水检查w理学检查w 性状w 颜色w 透明度w 有无凝块化学检查w 李凡它试验显微镜检查w 细胞总数计数w 白细胞计数w 白细胞分类计数
