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1、实验五实验五质粒质粒DNA的提取鉴定的提取鉴定n掌握掌握碱变性法碱变性法从大肠杆菌中提取质粒从大肠杆菌中提取质粒DNA原理原理和方法。和方法。n掌握掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒质粒DNA的技术。的技术。一、实验目的一、实验目的 质粒（质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子，大小从分子，大小从1kb到到200kb不等，具有不等，具有自主复自主复制和转录能力制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的并表达所携带
2、的DNA基因信息，但其复制和转录基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的。因此，没有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种质粒是一种寄生性的自主复制子。寄生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的细菌质粒是基因工程中常用的基因载体基因载体，也是，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。的好材料。二、实验原理二、实验原理l碱变性抽提法法碱变性抽提法法是常用的方法之一是常用的方法之一.l此法此法基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DN
3、A的变性与复性差异而达的变性与复性差异而达到分离的目的到分离的目的。l在在pH高达高达12.6的条件下的条件下，染色体，染色体DNA的氢键断裂、双螺的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的的Kac高盐缓冲液调节高盐缓冲液调节pH至中性时至中性时，变性的质粒，变性的质粒DNA又又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定
4、的大分不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理二、实验原理抽提中各种因素的影响，质粒抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以可能以三种形式三种形式存在：存在：1.共价闭环共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），常以超螺旋形式存在；），常以超螺旋形式存在；2.开环开环DNA（open circular DNA，ocDNA），此种质），此种质 粒粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松
5、弛的成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子；环状分子；3.线状线状DNA（linear DNA，lDNA），质粒），质粒DNA的两条的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋和超螺旋DNA。cccDNA含量越高，表明制备的质粒含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。质量越好。三、操作步骤三、操作步骤 1.取取2ml细菌培养液于细菌培养液于2ml Eppendorf离心管中，离心管中，4，5000rpm，离心，离心5min，弃上清
6、（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可能流尽），保留菌体沉淀。弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体尽可能流尽），保留菌体沉淀。2.沉淀悬浮于沉淀悬浮于100ul预冷的试剂预冷的试剂（TEG缓冲液）中，混匀（置混合器振缓冲液）中，混匀（置混合器振 荡），冰上置荡），冰上置10min。3.加入新配制的试剂加入新配制的试剂（碱裂解液）（碱裂解液）200ul，加盖，轻轻颠倒，加盖，轻轻颠倒34次，冰上置次，冰上置 10 min。4.加入预冷的试剂加入预冷的试剂（乙酸钾溶液）（乙酸钾溶液）150ul，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置10 min。12000rpm，4，离心，离心
7、10min，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。5.上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇，12000rpm，4，离心，离心10min。6.取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇=24：1）抽提，抽提，12000rpm，4，离心，离心10min。7.取上层水相置于另一离心管中，加入取上层水相置于另一离心管中，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后 置置20过夜（至少要放置过夜（至少要放置2
8、h以上）。以上）。8.12000rpm，4，离心，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。可能流出。9.加入加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4，离心，离心10min。10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。制品。11.将沉淀溶于将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入缓冲液，（临用前加入1u 或或20ug/ml RNaseA）待用。）待用。50 mM 葡萄糖葡萄糖25 mM Tris
9、-HCl10 mM EDTA-Na2200 mM NaOH 1%（W/V）SDS3 M NaAC省去省去25 min30 min 以上实实验验步步骤骤l 不同的不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。l 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为：的泳动速度次序为：共价闭环共价闭环DNA开环开环DNA线状线状DNA。l溴化乙锭溴化乙锭可插入到可插入到DNA分子的
10、双链中。在波长分子的双链中。在波长254nm紫外光照紫外光照射下插入溴化乙锭的射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂荧光指示剂指示指示DNA含量和位置。含量和位置。四、四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理的琼脂糖凝胶电泳原理 1.琼脂糖凝胶的制备：琼脂糖凝胶的制备：本实验采用本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称的琼脂糖凝胶。称取取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液，置于微波炉电泳缓冲液，置于微波炉使其充分融化。室温放置至使其充分融化。室温放置至60左右，加入左右，加入EB使其终浓度为使其终浓度为0.5ug/
11、ml，混匀，倒胶板（，混匀，倒胶板（30ml/板）。板）。2.凝胶板的制作：凝胶板的制作：用用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上，迅速将上面模板置于水平台上，迅速将上面胶液倒在模板的中央，让胶液自胶液倒在模板的中央，让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝由流向四周。待胶液充分冷却凝固，将胶纸围墙慢慢取下，制备固，将胶纸围墙慢慢取下，制备好的凝胶板放入电泳槽中，加电好的凝胶板放入电泳槽中，加电泳缓冲液直至没过胶面约泳缓冲液直至没过胶面约1mm深，深，取出
12、样品梳。取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤3.加样：加样：10 ul TE 溶解溶解+4 ul 上样上样缓冲液，取缓冲液，取10 ul点样点样4.电泳：电泳：l电压：电压：120Vl电泳时间：电泳时间：45 minl电泳终止：指示剂距离凝胶前电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约沿约1cm处处5.检测：检测：取出胶板，用紫外检测仪取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒观察结果。纯的质粒DNA只有超螺只有超螺旋旋DNA一条带。一条带。6.凝胶处理：凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防倒在垃圾中，以防EB污染。污染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤六、实验报告要求六、实验报告要求一、一、原理原理二、二、操作操作三、三、结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离）名称、强弱、距离）四、四、结果说明结果说明五、五、思考题思考题1、分离提取分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂的过程中哪些因素会引起链的断裂?2、本实验为了质粒本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？了哪些措施？
