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1、PATEXPLRER专利探索者一全球创新始于探索纳米凝胶酶及其制备和应用申请号：CN.6申请日：20170306申请（专利权）人：深圳大学地址：广东省深圳市南海大道3688号发明人：陈彦涛,陈正昭子,郑桂钦,龙玲1主分类号：C08F289/00公开（公告）号：CNB公开（公告）日：20200522代理机构：浙江永鼎律师事务所代理人：郭小丽(19)中华人民共和国国家知识产权局(21)申请号CN.6(12)发明专利(10)授权公告号CNB(45)授权公告日20200522(22)申请日20170306(71)申请人深圳大学地址广东省深圳市南海大道3688号(72)发明人陈彦涛，陈正鹏子，郑桂钦，龙
2、玲(74)专利代理机构浙江永鼎律师事务所代理人郭小丽暂无附图(54)发明名称纳米凝胶酶及其制备和应用(57)摘要本发明公开了一种纳米凝胶酶及其制备和应用。该纳米凝胶酶的制备方法，包括步骤：(1)利用N?丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰，制备辣根过氧化物酶?N?丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体；(2)用辣根过氧化物酶?N?丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应，制备得到纳米凝胶酶。该纳米凝胶酶的制备方法，绿色环保、反应条件温和、成本低，易于工业化。该纳米凝胶酶具有良好的水溶性、亲水性、生物相容性，可以有效的清除染料，可直接作为染料工业废水的降解材料。权
3、利要求书1.一种纳米凝胶酶的制备方法，其特征在于，包括步骤:（1）利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰，制备辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体；（2）用步骤（1）得到的辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应，制备得到纳米凝胶酶；所述具有两性离子特性的烯类单体选用竣酸甜菜碱丙烯酰胺、竣酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酸羟基乙酯磷脂酰胆碱中的一种或者两种以上；步骤（2）中，所述自由基聚合反应中还添加有引发剂、稳定剂和交联剂三种原料;所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺。2 .根据权利要求
4、1所述的纳米凝胶酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行化学修饰的反应条件包括：在溶液状态下搅拌反应至少2h；步骤（2）中，所述自由基聚合反应的反应条件包括：在溶液状态下搅拌反应至少2h。3 .根据权利要求2所述的纳米凝胶酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应条件包括：将辣根过氧化物酶溶于磷酸缓冲溶液中得到辣根过氧化物酶溶液；将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于二甲基亚飒得到N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶液；搅拌辣根过氧化物酶溶液并向辣根过氧化物酶溶液中滴加N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶液，搅拌反应至少2h；步骤（2）中，所述自由基聚合反应的反应条件包括
5、：在磷酸缓冲溶液中搅拌反应至少2h4 .根据权利要求1所述的纳米凝胶酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的用量为：N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔数量大于或等于辣根过氧化物酶中氨基的摩尔数量。5 .一种纳米凝胶酶，其特征在于，所述的纳米凝胶酶是根据权利要求4任一项所述的纳米凝胶酶的制备方法制备得到的。6 .根据权利要求5所述的纳米凝胶酶在直接作为染料工业废水处理材料或者用于制备染料工业废水处理材料中的应用。说明书纳米凝胶酶及其制备和应用技术领域本发明涉及纳米酶技术领域，具体涉及一种辣根过氧化物酶的纳米凝胶酶及其制备和应用。背景技术随着印染与染料工业的发展，染料废水
6、已成为当前主要的水体污染源，对环境及生物危害极大。然而，12%的工业废水并没有得到任何的处理，且经过治理的废水合格率仅63%。印染工业是我国的传统支柱行业，据不完全统计，我国每天染料废水排放量达到300万In3-500万In3,而这类废水的主要来源有纺织工厂和印染包装行业。染料废水有两个特点。第一，有机物含量高；染料大多是偶氮化合物，这类化合物会对生物的健康产生巨大威胁。第二，偶氮化合物化学稳定性极高，属于典型的高毒性、难降解的有机污染物，相关成分具有高度的持久性和扩散能力，会在水体、土壤等自然环境中持续滞留，并能引起生物富集，含有致癌因子。含偶氮染料的废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有
7、害废水之一。辣根过氧化物酶(HorSeradiShPeroxidase,HRP),又称为过氧化物酶。该类生物酶提取自微生物或植物，具有高效的催化能力，能促使体系释放大量氧自由基，可以看做是氧化法的高级形式，兼具生物法的诸多优点。近几年来，过氧化物酶在环境水处理领域引起了极大关注，被认为是最有前景的生物催化剂(KUlnar,V.,etal.horseradiShperoxidaseimmobilizedradiationgraftedpolymermatrix:abiocatalyticsystemfordyewastewatertreatment.RSCAdvances,2016,6,2976
8、)o但是天然的过氧化物酶稳定性差，在催化过程中易失活，不宜重复利用，大大限制了其在催化领域的应用。发明内容本发明提供了一种纳米凝胶酶，通过引入双键及具有两性离子特性的烯类单体对辣根过氧化物酶(HRP)进行分子层面的凝胶化包裹，提高其环境适应性，有效抵抗降解产物的吸附，利于回收循环再利用，利用其催化氧化能力，达到高效、绿色降解染料成份的目的。本发明以商品化的HRP作为初始原料。HRP是一种植物过氧化物酶，为单一肽链与辅基吓咻构成的血红素蛋白，分子量为44000Da,存在广泛，价格相对低廉，因其具有的高效催化性能和催化作用温和的特点，早在80年代中期，人们就发现HRP可以处理废水中多种含有羟基的化
9、合物，比如氯酚，而且对于催化降解工业染料废水如汽巴染料有较好的作用。本发明所述的纳米凝胶酶，是以IIRP为原料进行化学改性，引入双键，然后与具有两性离子特性的烯类单体进行自由基共聚而制得。具体技术方案如下：一种纳米凝胶酶的制备方法，包括步骤：(1)利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)对辣根过氧化物酶进行化学修饰，制备辣根过氧化物酶-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(HRP-NAS)大单体；IIRP-NAS大单体是一个含有双键的化合物；(2)用步骤得到的HRP-NAS大单体和具有两性离子特性的烯类单体进行自由基聚合反应，制备得到纳米凝胶酶。步骤(1)中，利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对辣根过氧化物酶进行
10、化学修饰的反应条件包括：在溶液状态下搅拌反应至少2h,利于反应的进行。为了达到更好的发明效果，优选：将HRP溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中得到HRP溶液；将NAS溶于二甲基亚碉(DMSO)得到NAS溶液；搅拌HRP溶液并向HRP溶液中滴加NAS溶液，搅拌反应至少2h。所述的NAS溶液最好一次性连续滴加完，更利于反应的进行。所述反应的反应温度并没有严格的限制，一般自然环境温度即可，比如常温或者室温等18-35的自然环境温度。所述磷酸缓冲溶液可采用现有方法配制也可采用市售产品，比如：O.lmolL-0.2molL的磷酸缓冲溶液。所述NAS的用量为：NAS的摩尔数量大于或等于HRP中氨基的摩尔数量，等
11、量或者过量的NAS可以完成对HRP中所有氨基的化学修饰。优选为：NAS的摩尔数量是HRP中氨基摩尔数量的1倍20倍。进一步优选为：NAS的摩尔数量是HRP中氨基摩尔数量的3倍8倍O优选，步骤(2)中，所述具有两性离子特性的烯类单体的单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团。进一步优选，所述具有两性离子特性的烯类单体选用含有丙烯酰胺基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物、含有丙烯酸酯基团且单体末端同时具有正电荷和负电荷的两性离子官能团的化合物中的一种或者两种。例如可选用竣酸甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)、竣酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA).磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA
12、)、2-甲基丙烯酸羟基乙酯磷脂酰胆碱(MPC)中的一种或者两种以上。CBAA结构式如式I所示：CBMA结构式如式II所示：SBMA结构式如式III所示：MPC结构式如式IV所示：所述自由基聚合反应中还可以添加有引发剂和稳定剂两种原料或者还可以添加有引发剂、稳定剂和交联剂三种原料。更利于自由基聚合反应的进行。所述引发剂可选用自由基聚合反应常用的引发剂，优选过硫酸钱(APS).所述交联剂可选用自由基聚合反应常用的交联剂，优选N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)；N,M-亚甲基双丙烯酰胺结构式如式V所示：所述稳定剂可选用自由基聚合反应常用的稳定剂，优选四甲基乙二胺(TEMED)O步骤(2)中，所述自由
13、基聚合反应的反应条件包括：在溶液状态下搅拌反应至少2h,利于反应的进行。优选在磷酸缓冲溶液中搅拌反应至少2ho为了达到更好的发明效果,进一步优选：将烯类单体和交联剂溶于磷酸缓冲溶液(PBS)中得到第一溶液：将引发剂溶于水得到第二溶液；将第一溶液、第二溶液和稳定剂加入步骤(1)的反应液中，搅拌反应至少2h0所述自由基聚合反应的反应温度并没有严格的限制，一般自然环境温度即可，比如常温或者室温等18C35C的自然环境温度。步骤(2)中，所述烯类单体与HRP的质量比为20:1,烯类单体与交联剂的质量比为1:0-1:0.3;当质量比为1:0时，即为不添加交联剂的情形。所述引发剂和稳定剂的用量并没有严格的
14、限制，按照自由基聚合反应常用的用量添加即可。步骤(2)中，所述自由基聚合反应完成后，采用本领域常用的提纯方法，比如：超滤离心、洗涤，即可得到纯化后的产物纳米凝胶酶。本发明原料均采用市售产品。本发明所述的纳米凝胶酶，是根据所述纳米凝胶酶的制备方法制备得到的。该纳米凝胶酶含有大量两性离子官能团，具有超亲水性，其特有的结构能够维持HRP的空间结构，提高其环境稳定性，有效抵御降解产物对HRP的吸附性污染，在工业废水尤其是染料工业废水的处理中具有广阔的应用前景。所述的纳米凝胶酶可以直接作为废水处理材料(例如染料工业废水处理材料)使用,也可以采用纳米凝胶酶为有效组分与现有的辅料或者辅材等一起用于制备废水处
15、理材料(例如用于制备染料工业废水处理材料)O本发明纳米凝胶酶可以处理辣根过氧化物酶能处理的所有染料(例如碱性红染料、靛蓝胭脂红染料等各种染料)的工业废水，并且降解效果显著优于HRPe本发明具有以下优点：(1)以HRP和具有两性离子特性的烯类单体为原料，合成具有超亲水性的纳米凝胶酶，在不影响酶溶解性的前提下，在分子层次上对酶进行凝胶化包覆，大大提高酶的稳定性，提高其环境适应性，可有效抵抗降解产物的吸附，利于回收循环再利用，利用其氧化能力，达到高效、绿色降解工业废水中染料的目的；而且本发明辣根过氧化物酶的纳米凝胶酶材料本身绿色无生物毒性，不会对环境造成二次污染。(2)本发明HRP纳米凝胶酶的合成步骤简单，可行性高、周期短，合成过程绿色环保、反应条件温和、成本低，易于工业化。按照本发明的方法进行化学修饰合成凝胶酶可以大大提高天然酶HRP的热稳定性及对染料的降解性能。(3)本发明纳米凝胶酶具有良好的水溶性、亲水性、生物相容性，可以有效的清除染料，可直接作为染料工业废水的降解材料。对于同一种染料，HRP和本发明纳米凝胶酶都对其有降解的效果，但本发明纳米凝胶酶的降解效果要远远高于HRP；在相同的降解时间下，本发明纳米凝胶酶对染料的降解效果远优于HRP,效果显著。附图说明图1为实施例2中各物质在不同浓度下的浓度-吸光值曲线图；其中，纵坐标
