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1、微核制片技术及其应用微核制片技术及其应用 (诱变剂的遗传毒性评价诱变剂的遗传毒性评价)一、实验目的一、实验目的1.了解微核检测的原理和毒理遗传学意义。了解微核检测的原理和毒理遗传学意义。2.掌握蚕豆根尖微核（或细胞电泳）监测环境污染的一掌握蚕豆根尖微核（或细胞电泳）监测环境污染的一般方法。般方法。3.学会利用微核测试系统评价环境物质的遗传毒理效应。学会利用微核测试系统评价环境物质的遗传毒理效应。二、实验原理（微核技术）二、实验原理（微核技术）1、微核（、微核（micronuclei,MCN）：）：是真核类生物细胞是真核类生物细胞经辐射或化学药物的作用而产生的一种游离于主核之外经辐射或化学药物的
2、作用而产生的一种游离于主核之外的的异常核结构异常核结构。在。在细胞间期细胞间期微核呈圆形或椭圆形，大小微核呈圆形或椭圆形，大小为主核为主核1/3以下以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成主核一样，也具合成DNA的能力。的能力。微核形态微核形态 2、微核的形成机理、微核的形成机理：许多：许多理化因素理化因素，如辐射、，如辐射、化学药剂等作用于分裂细胞，化学药剂等作用于分裂细胞，引起染色体断裂或干引起染色体断裂或干扰染色体行为扰染色体行为使之在使之在有丝分裂过程中行动滞后有丝分裂过程中行动滞后，末，末期未能进入主核，当子细胞进入下一次分裂间期时，
3、期未能进入主核，当子细胞进入下一次分裂间期时，便浓缩形成独立于主核之外的小核便浓缩形成独立于主核之外的小核微核。微核。3 3、微核率的、微核率的大小与用药剂量或辐射累积效应呈正大小与用药剂量或辐射累积效应呈正相关，相关，因此，可因此，可在间期进行微核的观察和计数来在间期进行微核的观察和计数来检测染色体畸变水平，检测染色体畸变水平，指示染色体或纺锤体的损指示染色体或纺锤体的损伤程度伤程度微核是常用的遗传毒理学指标之一。微核是常用的遗传毒理学指标之一。4 4、微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱、微核测试已用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊变剂、新药试验、
4、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等方面断等方面微核成因染色体作用于纺锤丝无着丝点，片或环整条染色体带着丝粒的环和断片于细胞分裂末期细胞质中形成微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成微核的形成微核的形成 70年代初，年代初，Matter和和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用一定定逐渐从动物、人扩展到植物领域。人和动物的微核测试多用一定培养条件与时间下的骨髓和外周血细胞，但细胞同步化困难，微核培养条件
5、与时间下的骨髓和外周血细胞，但细胞同步化困难，微核率低，约率低，约0.2%。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核测。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核测试材料，效果较好，其中试材料，效果较好，其中70年代末年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的用一种原产于美洲的鸭跖草，建立的四分孢子期微核率计数（鸭跖草，建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试系统，并首次用于监测水环境污染，经鉴定一套蚕豆根尖微核测试系统，
6、并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家已列入国家生物监测技术规范（水环境部分）生物监测技术规范（水环境部分）。美国国家环保。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，可以推广。环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，可以推广。三、实验用具三、实验用具1、材料：蚕豆（、材料：蚕豆（Vicia faba,2n=12）干种子）干种子 蚕豆根尖细胞的染色体大、数量少，蚕豆根尖细胞的染色体大、数量少，DNA含量含量高，根尖中含有较多的分裂相细胞，对诱变因子
7、反高，根尖中含有较多的分裂相细胞，对诱变因子反应敏感，且容易观察，是理想的遗传毒理分析材料。应敏感，且容易观察，是理想的遗传毒理分析材料。显微镜、培养箱、紫外灯、水浴锅、剪刀（或刀显微镜、培养箱、紫外灯、水浴锅、剪刀（或刀片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、滤纸片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、滤纸等。等。2、实验仪器及用具、实验仪器及用具 1mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品红染盐酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品红染液；液；NaN3（叠氮钠）、（叠氮钠）、EMS（甲基磺酸乙酯）、（甲基磺酸乙酯）、DES（硫酸二乙酯）等化学诱变剂等；（硫酸二乙酯）等化学诱变剂等；紫外线、微波等
8、物理诱变因子。紫外线、微波等物理诱变因子。3、药品和试剂、药品和试剂1、浸种催芽、浸种催芽：25下浸泡下浸泡24h，吸胀后，用河沙作发芽床，吸胀后，用河沙作发芽床，25培养箱中催芽培养箱中催芽1224h，初生根长出，初生根长出23mm时，取发芽良好的时，取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25继续催芽，大部分根长至继续催芽，大部分根长至12cm（约（约3648h）。2、染毒：、染毒：用被检测液处理根尖。每处理选用被检测液处理根尖。每处理选68粒初生根生长良粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入培养皿中，用被检测液浸没根尖。阳性因好、根长一致的种子，放入培养皿中，
9、用被检测液浸没根尖。阳性因子可采用子可采用NaN3和紫外线等，和紫外线等，0.2、0.4、0.8mmol/L NaN3溶液。紫溶液。紫外线分别处理外线分别处理20、40、60min。另外可取一处污水作被检液之一。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖1224h。3、根尖细胞恢复培养：、根尖细胞恢复培养：处理后的种子用自来水（或蒸馏水）处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次浸洗三次，每次23min。洗净后置入辅有湿润滤纸的瓷盘中，。洗净后置入辅有湿润滤纸的瓷盘中，25下恢复培养下恢复培养2224h。四、实验操作流程四
10、、实验操作流程4、根尖细胞固定并保存：、根尖细胞固定并保存：切取恢复后的切取恢复后的1cm长的幼根，甲醇：长的幼根，甲醇：冰醋酸（冰醋酸（3：1）液固定）液固定24h。置置70%的乙醇中保存于的乙醇中保存于4冰箱中。冰箱中。5、解离：、解离：加入加入1mol/L盐酸浸没幼根盐酸浸没幼根10min，使幼根软化。解离前，使幼根软化。解离前后用蒸馏水清洗干净。后用蒸馏水清洗干净。6、染色、压片：、染色、压片：截取截取12mm长的根尖置载玻片上，滴一滴染长的根尖置载玻片上，滴一滴染液，染色液，染色58min，加上盖玻片，压片。，加上盖玻片，压片。7、镜检观察、计数：、镜检观察、计数：首先在低倍镜下找到
11、分生组织区细胞分散首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。每一处理观察每一处理观察3个根尖，每个根尖数个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN，即微核千分率。，即微核千分率。五、结果与分析五、结果与分析微核识别标准：微核识别标准：（1）在主核大小的）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。以下，并与主核分离的小核。直径大约是细胞直径的直径大约是细胞直径的1/201/5。（2）小核着色与主核相当或稍浅。）小核着色与主核
12、相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则形。）小核形态为圆形、椭圆形或不规则形。处理观察的细胞数 微核数总计 微核NaN3(mmol/L)0.20.40.8紫外线(min)204060蚕豆根尖微核检测记录表蚕豆根尖微核检测记录表注：以小组为单位统计平均微核千分率。注：以小组为单位统计平均微核千分率。处理观察的细胞数 微核数总计 微核NaN3(mmol/L)0.20.40.8蒸馏水计算各测试样品（包括对照）的微核千分率（计算各测试样品（包括对照）的微核千分率（MCN）：）：样品污染（中毒）程度的确定：样品污染（中毒）程度的确定：MCN10，基本没有污染（中毒），基本没有污染（中毒）；10
13、MCN18，轻度污染（中毒），轻度污染（中毒）；18MCN30，中度污染（中毒）；，中度污染（中毒）；MCN30，重度污染，重度污染（中毒）。（中毒）。某样品或对照观察到的微核数某样品或对照观察到的微核数某样品或对照观察到的细胞数某样品或对照观察到的细胞数MCN=1000 “污染指数污染指数”判别（此方法可避免因实验条件等因素带来的判别（此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN本底的波动）：本底的波动）：样品实测微核平均千分率样品实测微核平均千分率 对照平均微核千分率对照平均微核千分率 0PI1.5，基本没有污染；，基本没有污染；1.5PI2，轻度污染；，轻度污染；2PI3.5，中度污染；，中度污染；PI3.5，重度污染。，重度污染。污染指数污染指数PI=MNNCE单个微核多个微核骨髓细胞微核的形成骨髓细胞微核的形成 洋葱微核的形成洋葱微核的形成 分析药物或污染源处理后，对蚕豆微核率分析药物或污染源处理后，对蚕豆微核率的影响，比较诱变因子作用的大小。的影响，比较诱变因子作用的大小。思考题：思考题：在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？恢复培养？
