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1、生物素亚适量法生产谷氨酸组员o 李振国o 芦敏o 刘祺o 陆姗姗o 李雷达o 董呈呈o 万东o 刘玉洋一、实验目的o 1、掌握谷氨酸发酵的原理o 2、掌握谷氨酸种子制备的方法o 3、掌握谷氨酸发酵过程中的条件控制o 4、掌握谷氨酸发酵液提取谷氨酸的方法o 5、掌握谷氨酸纯化的方法o 6、探究不同糖浓度对菌种生长的影响二、发酵原理o1.合成途径合成途径o谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成-酮戊二酸。-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏
2、时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。o在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透
3、性。发酵原理o2.发酵过程发酵过程o在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。温度。菌种生长的最适温度为3032。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到3437。pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.08.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需
4、的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。发酵结束后，常用离子交换树脂法等进行提取。三、实验试剂与仪器o 试剂：葡萄糖、尿素、硫酸镁、磷酸氢二钾、玉米浆、硫酸亚铁、硫酸锰、水解糖、玉米浆、K2HPO、MgSO4、尿素、FeSO4 2ppm、MnSO4、NaS、活性碳o 仪器：500ml三角瓶2个、接种环、酒精灯、摇床、超净工作台、抽滤装置、烧杯、试管、发酵罐、离子交换柱、PH试纸或者PH计、1L量筒2个、200ml三角瓶5个、高压锅操作步骤操作步骤 o1一级种子培养工与制：按下列培养基配方配制1000ml一级种子培养基。按20%装液量分装后，于121灭菌30min冷却备用。o葡萄糖 2.5%尿
5、素0.5%硫酸镁0.04%o磷酸氢二钾0.1%玉米浆 2.53.5%o硫酸亚铁、硫酸锰各20ppm、pH7.0o2一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基中（250ml三角瓶内接入12环）于321、250r.p.m条件下培养12h。一级种子质量要求：o种龄 12h pH6.40.1o光密度：净增O.D值0.5以上o无菌检查阴性，噬菌体检查无。四、操作步骤o3二级种子培养基配制：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121灭菌30min冷却备用。o水解糖2.5%玉米浆2.53.5%K2HPO4 0.15%oMgSO4 0.04 尿素0.4%
6、FeSO4 2ppmoMnSO4 2ppm pH 6.87.0o4二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.51.0%接入上述已培养好的一级种子，于321、250r.p.m条件下培养78h，二级种子质量要求：o种龄78h pH 6.87.2 OD值净增0.5左右o无菌检查（一）、噬菌体无、残糖消耗1%左右o镜检生长旺盛，排列整齐，G+操作步骤o5发酵培养基配制按下列培养基配方制发酵培养基，并按20%装液量分装于250ml三角瓶中，水解糖10%，甘蔗糖蜜0.180.22%，玉米浆0.10.15%，Na2HPO4 0.17%，KCl 0.12%、MgSO4 0.04%，用NaOH（5%）溶液
7、调pH 7.20于110灭菌20min冷却备用。o6发酵：按810%的接种量在发酵培养基中接入合格的二级种子注，于351、250 r.p.m条件下发酵35h，发酵过程中从第4h后开始用无菌注射器补入尿素，尿素流加按pH值进行控制即8h前pH 7.07.6；8h后pH7.27.3，2024hpH 7.07.1，2435h，pH6.56.6。尿素流加总量为4%。从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。o7镜检及谷氨酸测定：在8h及24h时分别各取样一次进行镜检，经单染后观察菌体形态，发酵结束后，用华勃氏呼吸器测定发酵液中谷氨酸含量。操作步骤o 8、
8、谷氨酸的离子交换层析谷氨酸的离子交换层析 在溶液的pH小于3.22时，谷氨酸分子带正电荷，可以用阳离子交换树脂进行层析分离。由于在此条件下，阳离子交换树脂对谷氨酸的吸附力较弱，所以应采用强酸性阳离子交换树脂，若采用弱酸性阳离子交换树脂，则吸附性较差，容易脱落；酸使稀硫酸 操作步骤o 谷氨酸钠的生产谷氨酸钠的生产o 纯化谷氨酸中和脱色浓缩结晶分离味精发酵生产工艺流程 一一、谷氨酸的中和、谷氨酸的中和o 谷氨酸的中和是指谷氨酸与碱或碱性盐反应生成谷氨酸钠的过程。o 中和作用所使用的碱是氢氧化钠，使用的碱性盐为碳酸氢钠或碳酸钠。o 在谷氨酸钠的生产过程中，控制中和液的pH在6.46.7的范围，就可使
9、谷氨酸大部分生成谷氨酸钠。pH过低，则中和不完全；pH过高，则生成较多谷氨酸二钠，都会使谷氨酸钠生成率降低。o 温度一般控制在60左右。二二、除铁、除铁o 在谷氨酸加碱中和后，中和液还需要进行除铁过程，即通过一些处理，以除去存在于中和液中过量的铁离子。o 由于铁离子容易氧化变成黄色，对谷氨酸钠的质量有所影响。所以谷氨酸钠产品必须控制铁离子的含量，一般要求低于5mgkg。(1)硫化钠除铁o 硫化钠除铁是在谷氨酸中和液中加入一定量10%左右浓度硫化钠溶液，生成硫化亚铁沉淀。o Fe2+Na2S FeS+2Na+o 由于硫化亚铁在碱性条件下几乎不溶于水，而在酸性条件下溶解度较大，所以在操作时为了除铁
10、较完全，应控制好pH，并加入稍过量的硫化钠。(2)离子交换树脂除铁 o 谷氨酸中和液中的铁，一般以二价或三价铁离子存在。可以采用适当的离子交换树脂进行离子交换而除去。o 我国常用于谷氨酸中和液除铁的离子交换树脂有通用一号树脂、122弱酸性阳离子交换树脂和酚醛树脂等。o 采用离子交换树脂除铁，除铁较完全，而且不会有残留的硫化钠存在于谷氨酸钠产品之中，在实际生产中较多采用。三、脱色三、脱色o(1)活性炭脱色o 采用颗粒状的活性炭进行脱色时，一般是让谷氨酸钠溶液通过活性炭柱，色素被吸附，而得到的流出液为脱除了色素的谷氨酸钠溶液。o 采用粉末状活性炭进行谷氨酸钠溶液的脱色时，一般是将粉末状的活性炭按溶
11、液体积的1%2%的比例加到谷氨酸中和液中，不断搅拌2h左右，使活性炭充分吸附色素，然后通过过滤除去，以达到脱色目的。(2)离子交换树脂脱色o 由于谷氨酸钠溶液中所带的色素大部分是与蛋白质结合的大分子物质，一般带负电荷，所以，选用的脱色树脂一般都是大孔径的阴离子交换脱色树脂。o 脱色是在谷氨酸中和、除铁以后进行，中和液的pH为6.46.7。脱色温度以4050为宜。四、四、浓缩与结晶浓缩与结晶 经过上述中和、除铁、脱色处理以后，得到较纯的谷氨酸钠溶液。该溶液含有大量的水，需要经过浓缩与结晶，才能得到所需的谷氨酸钠结晶产品。o 1、浓缩o 在6570条件下进行蒸发浓缩，当溶液浓度达到3030.5波美
12、度时，即可加入谷氨酸钠晶种进行结晶。o 2、结晶 自然起晶、刺激起晶、晶种起晶o 加入的晶种颗粒的大小一般为2440目，加入量一般为谷氨酸钠含量的10%15%。加入晶种后，慢慢搅拌。o 五、干燥五、干燥o 真空干燥、气流干燥、红外线干燥、冷冻干燥、吸附干燥、喷雾干燥等。在谷氨酸钠结晶的干燥方面，常用的有真空干燥和气流干燥等。味精发酵设备（参考）说明：oppm是英文parts permillion的缩写，译意是每百万分中的一部分，即表示百万分之（几），或称百万分率。如1ppm即一百万千克的溶液中含有1千克溶质。ppm与百分率（）所表示的内容一样，只是它的比例数比百分率大而已。o在花卉生产栽培中，常常施用“微肥”和“植物激素”，这些药剂在施用时，其用量甚微，每千升的容量中只含有几毫克甚至更少，故用“ppm”来表示。也就是说，在配制1ppm浓度时，1克农药或肥料(指纯量)加水1吨(1000000克)，目前，在大多数科技期刊中，已经不使用ppm，而改用“”，ppm换算成为：1ppm=0.001。o简单的说：1ppm=1mg/kg=1mg/L=110-6 o常用来表示气体浓度，或者溶液浓度。
