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1、酶快速反应动力学酶快速反应动力学Kinetics of Fast Enzyme Reaction第一章第一章 绪论绪论Introduction to Enzyme Kinetics酶反应的稳态动力学和瞬变动力学酶反应的稳态动力学和瞬变动力学 酶反应动力学是解释酶反应机制具有代表性的方法。酶动力学包括两个方面，即酶的稳态动力学（Steady-state kinetics）和预稳态动力学（Pre-steady state kinetics），后者也叫瞬变动力学（Transient kinetics）。酶的稳态动力学的基本目标是对酶催化的总反应进行测量与分析，只涉及底物与产物，而不考察酶分子本身。预
2、稳态动力学可以直接研究总反应中所包含的分步反应。研究者的兴趣所在是酶分子本身所发生的变化或能够反映这种变化的变化上。两种动力学方法各有其优缺点。稳态动力学由于所要求酶制剂用量少，且不需要使用特殊的仪器设备，因而长久以来获得了广泛的应用。这种方法的缺点在于研究人员所获得的信息是间接的，有时也是不确切的。预稳态动力学由于测量快速反应，而需要特殊的仪器设备（例如，停流装置）。它的优点是可以提供用来解释复杂反应机制的信息。应该指出，两种方法是相辅相成的，对于研究酶反应来说都很重要。从二十世纪60年代起，测量快速反应的技术发展很快，性能越来越好的测量快速反应的装置（如，停流分光光度计等）被不断推出，这给
3、研究酶反应的瞬变动力学提供了很大的方便。第一节第一节 研究酶反应的历史研究酶反应的历史一一.Henri 的工作的工作 Henri 在1902年发表了一篇论文。他首次引入了一个十分重要的概念，既酶与底物符合物的概念，并把它用到速度方程的推导中。随后，他讨论和阐述了重要的酶反应的动力学特征，涉及到三种酶反应：1.蔗糖转化酶(Invertase)催化蔗糖的转化；2.淀粉酶(Amylase)催化糊精的水解；3.苦杏仁酶(Emulsin)催化水杨苷的水解。对实验结果归纳成如下几个要点：1.当底物浓度低时，酶催化的水解速度随底物浓度的增加而增加；当底物浓度高时，水解速度保持恒定。2.反应速度与酶浓度成正比
4、；3.产物的加入引起反应速度的减少，在低底物浓度时，减少尤明显。上述实验结果可以用下面两种反应机制解释,机制 I:(1.1.1)(1.1.2)机制 II:(1.1.3)(1.1.4)E+S k+1k-1ESE+S k+1k-1ESE+S k+1E+PESE+Pk+2 如果考虑产物与酶结合生成EP，那么要把下述平衡包括到上述每一个机制中去，(1.1.5)在上述两种机制中，ES符合物的形成是共同的，然而所起的作用却是完全不同的。在机制 I 中，产物的形成是通过一个双分子过程（1.1.2式），即酶与底物的碰撞。在此种情况下，ES符合物是无意义的，它通过减少E浓度而降低产物的形成速度。另一方面，在机制
5、 II中，ES是至关重要的符合物，经过一个单分子过程（1.1.4式），ES复合物形成产物。下面要推导出能同时满足上述两种机制的速度方程。当考虑EP复合物的形成时，酶以三种形式存在：E,ES 和 EP。因此，酶的总浓度为 e0=E0=E+ES+EP (1.1.6)假定在酶反应中，下述平衡迅速建立起来 E+Pk+3E+Pk-3E+S k+1k-1ESE+Pk+3E+Pk-3ESE S=ESEa-x=k+1k-1m应用质量作用定律，有EPE P=EPEx=k+3k-3n(1.1.7)(1.1.8)其中，m和n 为平衡常数，x为底物在时间t时的浓度，那么，S=a-x，这里a为底物起始浓度。P=x,这是
6、两个可以测量的量。式1.1.6,1.1.7和1.1.8 组成一个联立方程组，含有三个未知量。E和ES的表达式为，E=e01+m(a-x)+nxES=1+m(a-x)+nxme0(a-x)(1.1.9)(1.1.10)利用1.1.9和1.1.10式，产物P生成的速度方程可以推倒如下，对于机制 I,P通过一个双分子过程形成，产物的生成速度为(下面式子应为k+1)对于机制 II，产物以单分子过程形成(1.1.4式)，产物的生成速度为：(1.1.11)和(1.1.12)式仅差一个常数。为简化起见，只考虑反应的初相，可忽略产物的形成，因而P=x 可以略去。在t=0时，初始速度为，初始底物浓度为s0，ES
7、解离常数为Ks=1/m,1+m(a-x)+nx(a-x)=dx/dt=k-1ES k-1 e0(1.1.11)1+m(a-x)+nx(a-x)=e0=k+2ESdx/dtk+2m(1.1.12)那么，我们可以把(1.1.11)和(1.1.12)式简化成如下形式，其中，k0为比例常数，具有sec-1因次。对机制 I：k0=Ks 为E和S间双分子反应速度常数；Ks为ES复合物解离常数。值得注意的是Henri机制II（1.1.3和1.1.4式）和速度方程1.1.13式与著名的Michaelis-Menden 机制和米氏方程相同。Henri是第一个得到为人熟知的速度方程的人。Henri 工作的特点：由
8、不同的反应机制出发得到了形式相同的速度方程。换句话说，机制 I 和机制 II 不能用这里讨论的动力学方法加以区别，因为我们无法估计速度方程中经过推导而演绎出的常数。这说明了动力学方法的固有的限制，尽管两种机制可以借助于不同的动力学技术加以区别。0=k0 e0 s0Ks+s0(1.1.13)k+1k+1k+1二二.Michaelis and Menten 的工作的工作 1913年年Michaelis and Menten 重新做了蔗糖反应转化酶催化的蔗糖水解反应的实验。他们改进了实验条件，克服了Henri实验的缺点，采取了如下的措施：1.控制水溶液的pH，使用了pH4.5的醋酸buffer;2.
9、考虑了产物的变旋影响，使用NaOH终止反应，加速产物的变旋作用。典型的实验曲线如Fig.1.1.1所示，Fig.1.1.1蔗糖反应转化酶催化的蔗蔗糖反应转化酶催化的蔗糖水解反应的时间过程糖水解反应的时间过程最大底物浓度为0.333M;最小底物浓度为0.0052M;曲线1,2,3,.代表不同的底物浓度；:产物完成变旋后反应混合物旋光度的变化。产物：Glucose and fructose.。Henri在他的实验中测量的是反应速度常数，而Michaelis and Meten建议利用反应初速度作为反应速度的一种测量。测量反应初速度的优点在于可以消除产物可能产生的抑制作用以及在反应进行期间酶的钝化。
10、基于与Henri 机制 II相同的图示，（1.1.14)M-Menten 利用与Henri使用的基本相同的方法得到了一个速度方程。推导如下：假定E和S的结合是处于快速平衡，即 则ES的解离常数 （1.1.15)E+S k-1k+1ES k+2E+PE+S k-1k+1ES Ks=k-1/k+1=E SES由物种守恒，有 e0 E0=E+ES （1.1.16)因只考虑反应初速度，固EP项可漏掉，反应速度（初速度）为 =k+2 ES （1.1.17)由1.1.15-1.1.17式，有 （1.1.18)其中 V=k+2 e0 为最大反应速度。与Henri 机制 II 比较，k0=k+2,则（1.1.
11、18)式与(1.1.13)式相同。1.1.18式就是Henri,Michaelis 和menten 推导 出的第一个讨论酶反应的速度方程。快速平衡法的基本假定是下述平衡 =k+2 e0sKs+s=V sKs+sE+S k+1k-1ES迅速地建立起来，以致于ES E+P 并不影响这一平衡。而由ES到产物生成这一步是反应的限速步骤。解离常数Ks的倒数可以作为酶对底物的一种测量。然而，应该指出，快速平衡法的基本假定有时不能成立，因为有的反应 E+S ES是不成立的。后来，稳台法对这一点做了改进。三三.Brigg 和和Haldane的工作的工作 在H-M-M法中，假定 中的k-1k+2，这是一种特殊的
12、限制。1925年 Brigg 和Haldane对-M-M法做了改进，他们在推导速度方程时把 k-1k+2这一假定取消了。他们的方法就是现在大家熟知的稳态法或称为稳态近似。在酶反应的过程中，中间产物ES一直稳定存在。ES的浓度变化可用下式表示 dES/dt=k+1ES (k-1+k+2)ES (1.1.19)E+S k-1k+1ES k+2E+P在反应刚开始时，我们可以近似地认为反应速度=k+2 ES 是不变的，因为ES也不变。换句话说，dES/dt 与反应的总速度比较起来可以忽略不计。故有 dES/dt=0则1.1.19式变成 k+1ES (k-1+k+2)ES=0 （1.1.20)这个式子代
13、替了迅速平衡法中的1.1.15式(Ks=ES/ES)。利用物种守恒 e0=E0=E+ES （1.1.21)由（1.1.20)和（1.1.21)式得到ES复合物表达式 （1.1.22)将（1.1.22)代入速度方程=k+2 ES,则 （1.1.23)ES=E0 SES+k-1+k+2k+1k-1+k+2k+1k+2 e0s+s=k+2ES=在该法中唯一的假定是dES/dt=0,取消了快速平衡法中的两个假定这意味着稳态法较快速平衡法优越。容易看出（1.1.18)式为（1.1.23)式的特例，即当k-1 k+2 时，（1.1.23)式变成了（1.1.18)式。第二节第二节 酶反应动力学方法酶反应动力
14、学方法一一.速度参数速度参数(Rate parameters)由H-M-M 酶反应机制导出的速度方程有下面的形式 E+S ES(1)(2)ES E+P快速平衡限速步骤E+S k-1k+1ES k+2E+P =e0s+s(1.2.1)其中和是常数。这个方程预示着：1.在底物浓度不变的情况下，反应速度与酶浓度成正比；2.在底物浓度低时，s ，反应速度达到一常量e0。反应速度与酶浓度的关系，以及与底物浓度的关系如1.2.1和1.2.2所示，Fig.1.2.1 反应初速度与酶的反应初速度与酶的总浓度的关系总浓度的关系Fig.1.2.2 反应初速度与底物浓度反应初速度与底物浓度关系关系 如果定义两个变量
15、x和y，x=+s y=e0 （1.2.2)那么，(1.2.1)式可以变成如下形式，xy=e0 这是矩形双曲线，极值为 V=e0 与e0 呈正比。常数为当=V时，所对应的底物浓度，成为Michaelis 常数，用Km值表示。=V/e0 表示单位时间内一个酶分子可以转化的底物分子数，称为分子活力（Molecular activity),用k0 表示。对于寡聚酶来说，常使用催化中心活力的术语，即单位时间内酶分子中每个催化中心所能转化的底物分子数，用kcat（Catalytic center Activity)表示。Kcat=k0/n 。有时，把分子活力或催化中心活力叫转化数（turnover num
16、ber)。这些在实验上可以测得的参数是进行动力学分析的基本常数，通常成为速度参数或动力学常数，包括 Km,k0(or kcat)。现在，我们用Km,V,k0(or kcat)代替速度方程中的和，那么速度方程有如下形式 （1.2.3)对大多数酶反应来说，速度方程有如（1.2.3)式的形式，但也有例外，变构酶，反应速度对底物浓度关系为s型曲线，而非双曲线。应该指出，在实验中测得的速度参数或动力学常数是表观的，它们的真实物理意义并不清楚。仅当我们把经验的速 度方程（empiricalRate equation)与由假定的机制推导的力学方程（mechanistic rateEquation)相比较时，这些参数如Km 和 k0（empirical constants)，它们的物理意义才清楚：=e0s+s=k0 e 0sV sKm+s=Km+=snkcate0sKm+s empirical rate equation （1.1.18)由快速平衡法推导的方程 （1.2.3)k0=k=2 是ES复合物分解成产物的速度常数；Km=Ks是ES复合物解l离常数。比较（1.1.18)和（1.1.23)两式，e
