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1、醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白【实验目的】【实验目的】1、了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素、了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术；薄膜电泳操作技术；2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法。方法。实验六实验六【实验原理】【实验原理】由于各种血清蛋白质的等电点不同，由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在因此在pH 8.6的缓冲液中，各种血清蛋白的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋
2、酸纤维薄膜上电泳后，可将各种所以在醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。血清蛋白质分离开。血清中含有清蛋白，血清中含有清蛋白，-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性碱性PHPH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物
3、，正常人血清在例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6PH8.6的缓冲体系中电泳的缓冲体系中电泳1h1h左右，染色后可显示左右，染色后可显示5 5条条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为区带。清蛋白泳动最快，其余依次为1 1-、2 2-、-及及-球蛋白（如图球蛋白（如图3-53-5）。）。图图3-53-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1 1为清蛋白，为清蛋白，2 2，3 3，4 4，5 5分别分别1 1-，2 2-，-及及-球蛋白，球蛋白，6 6为点样原点为点样原点 这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接
4、进行光吸收扫描自动绘出区带也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。吸收峰及相对百分比。此法由于操作简单，快速，分辨率高及此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。白及同工酶的分离测定。【实验材料】【实验材料】1电泳仪电泳仪 包括直流电源整流器和包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。电泳槽两个部分。2醋酸纤维素薄膜。醋酸纤维素薄膜。4 4 试剂试剂 巴比妥巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液(pH8.6,0.07mol/L,(pH8.6
5、,0.07mol/L,离子强度离子强度0.06)0.06)称取称取1.66g1.66g巴比妥（巴比妥（ARAR）和）和12.76g12.76g巴比妥钠（巴比妥钠（ARAR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL1000mL。置。置40C40C保存，备用。保存，备用。血清蛋白染色血清蛋白染色染色液（染色液（0.5%0.5%氨基黑氨基黑10B10B）：称取）：称取0.5g0.5g氨基黑氨基黑10B10B，加蒸馏水加蒸馏水40mL40mL，甲醇（，甲醇（ARAR）50mL50mL，
6、冰乙酸（，冰乙酸（ARAR）10mL10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。漂洗液：取漂洗液：取95%95%乙醇（乙醇（ARAR）45mL45mL，冰乙酸（，冰乙酸（ARAR）5mL5mL和蒸馏水和蒸馏水50mL50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。，混匀置具塞试剂瓶中贮存。透明液：临用前配制。透明液：临用前配制。甲液：取冰乙酸（甲液：取冰乙酸（ARAR）15mL15mL，无水乙醇（，无水乙醇（ARAR）85mL85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（乙液：取冰乙酸（ARAR）25mL25mL，无水乙醇（，无水乙醇（
7、ARAR）75mL75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。保存液：液体石蜡。保存液：液体石蜡。定量洗脱液（定量洗脱液（0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH溶液）：溶液）：称取称取16g16g氢氧化钠（氢氧化钠（ARAR）用少量蒸馏水溶解后定容）用少量蒸馏水溶解后定容至至1000ml1000ml。【实验方法与步骤】实验方法与步骤】1 1、仪器与薄膜的准备、仪器与薄膜的准备 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在的平皿中，
8、若漂浮于液面的薄膜在15-30s15-30s内迅速内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约液中约30min30min后，方可用于电泳。后，方可用于电泳。电泳槽的准备电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的
9、滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。滤纸桥。电极槽的
10、平衡电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。2 2、点样、点样取一张干净滤纸（取一张干净滤纸（101010cm10cm），在距纸边），在距纸边1.5cm1.5cm处处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓
11、冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2-3L2-3L血血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，如图区内，如图3-63-6所示，使血清完全渗透至薄膜内，所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握
12、点样技术后再正式点样。掌握点样技术后再正式点样。图图3-6 3-6 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）（虚线处为点样位置）3 3、电泳电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图架上，如图3-73-7所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜则薄
13、膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡平衡10min10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为强度为0.3mA0.3mA（8 8片薄膜则为片薄膜则为4.8mA4.8mA）。通电）。通电10-15min10-15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA0.5mA（8 8片共片共8mA8mA），电泳时间约），
14、电泳时间约50-80min50-80min。电泳后调节旋扭。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。使电流为零，关闭电泳仪切断电源。图图3-7 3-7 电泳装置剖视示意图电泳装置剖视示意图 1.1.纸桥纸桥 2.2.电泳槽电泳槽 3.3.醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜 4.4.电泳槽膜支架电泳槽膜支架 5.5.电极室中央隔板电极室中央隔板4 4、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%0.5%氨氨基黑基黑10B10B染色液的培养皿中，浸染染色液的培养皿中，浸染5min5min，取出
15、后，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min10min换漂洗换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。吹干。图图 3-8 3-8 血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图图谱比较示意图a.a.蛋白染色蛋白染色 b.b.脂蛋白染色脂蛋白染色6 6、结果判断与定量、结果判断与定量一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示5 5条区条区带，其排列顺序见图带，其排列顺序见图3-8a3-8
16、a，未经透明处理的电，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含量。分相对百分含量。本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫本实验不要求进行定量分析，如有需要，可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：行定量。下面为后者的具体操作步骤：取试管取试管6 6支，编好号码，分别用吸管取支，编好号码，分别用吸管取0.4N0.4N氢氧化钠氢氧化钠4ml4ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长用长用650nm650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白白A A、11、22、球蛋
