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1、实验三实验三 鱼类的急性毒性实验鱼类的急性毒性实验 目的与要求目的与要求 实验原理实验原理 实验材料实验材料3 3 实验步骤实验步骤 实验报告实验报告 注意事项注意事项6 64 41 12 25 通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。和报告等全过程。1 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生
2、理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行实验至少进行24h，最好以，最好以96 h为一个实验周期，在为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期
3、暴露效应价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。废水排放提供环境依据。2 1实验鱼的选择与驯养实验鱼的选择与驯养 试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性，试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性，便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康。我国可便于实验条件下饲养，来源丰富，个体
4、健康。我国可采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼等。本实验选和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼等。本实验选用鲫鱼作为实验鱼。用鲫鱼作为实验鱼。在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄，在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄，最好是当年生。鱼的平均体长以最好是当年生。鱼的平均体长以7cm以下为合适。金以下为合适。金鱼体短、身宽，一般以鱼体短、身宽，一般以3cm以下较为合适。同组鱼中以下较为合适。同组鱼中最大的体长不应超过最小的体长的最大的体长不应超过最小的体长的1.5倍。倍。3 选用的试验鱼在试验前必
5、须在实验室内经过驯养，使选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应该与试验相同水质水温的水体中至少驯养该与试验相同水质水温的水体中至少驯养7d，使其适应试，使其适应试验环境，不应长期养殖（验环境，不应长期养殖（2个月）。驯养期间，应每天换个月）。驯养期间，应每天换水，可每天喂食水，可每天喂食1-2次，但在试验前一天应停止喂食，以免次，但在试验前一天应停止喂食，以免试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡率不得超过率不得超过5，否则，
6、可以认为这批鱼不符合试验鱼的要，否则，可以认为这批鱼不符合试验鱼的要求，应该继续驯养或者重新更换试验鱼进行驯养。求，应该继续驯养或者重新更换试验鱼进行驯养。试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都不得作试验鱼。不得作试验鱼。3 2实验仪器设备实验仪器设备 （1）实验容器）实验容器 实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族实验容器一般用玻璃或
7、其他化学惰性材质制成的水族箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为（最好为1g）。一些小型鱼类）。一些小型鱼类幼鱼可选择幼鱼可选择500mL或或 1000mL烧杯为实验容器。容器的深烧杯为实验容器。容器的深度必须超过度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，以除去所上加上网罩。实验容器使用后，
8、必须彻底洗净，以除去所有毒性残留物。有毒性残留物。（2）其他）其他 溶解氧测定仪溶解氧测定仪、水硬度计水硬度计、温度控制仪温度控制仪、pH计计、分析分析天平天平。3 3实验用水（稀释水）及水质条件实验用水（稀释水）及水质条件 用来驯养和配置实验液的水，必须是未受污染的清用来驯养和配置实验液的水，必须是未受污染的清洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤以除去大的悬浮物质。也可用自来水代替，但必须进行以除去大的悬浮物质。也可用自来水代替，但必须进行人工曝气或放置人工曝气或放置3d以上脱氯。如果试验目的是评价工业以上脱氯。如果试验目的是评价工
9、业废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合做稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类，做稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类，与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试验结果。水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试验结果。3 实验用水的水质条件一般是指水的温度、实验用水的水质条件一般是指水的温度、pH、溶、溶解氧、硬度、水中的有机物和水量等。解氧
10、、硬度、水中的有机物和水量等。（1）水温）水温 实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼在在1218，温水鱼在，温水鱼在2028。为使得实验结果可。为使得实验结果可靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过4（即（即2）。冬天可以通过加热室内的空气温度而达到调）。冬天可以通过加热室内的空气温度而达到调节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。3 （2）pH 水的水的pH与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒物的毒性作用也有一定
11、的影响。因此，在实验中应维物的毒性作用也有一定的影响。因此，在实验中应维持持pH在鱼类适宜范围内。一般实验液的在鱼类适宜范围内。一般实验液的pH在在6.78.5为宜。如需调节为宜。如需调节pH，可用，可用1M或或0.1M的的HCl和和NaOH来来调节受试物贮备液的调节受试物贮备液的pH。调节贮备液的。调节贮备液的pH时不能使时不能使受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。（3）溶解氧）溶解氧 溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在4m
12、g/L以上，以上，冷水鱼要求溶解氧在冷水鱼要求溶解氧在 5mg/L以上。以上。（4）硬度）硬度 水的总硬度为水的总硬度为 10250 mg/L（以（以CaCO3计）。计）。3 1预实验预实验 用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围的浓度系列，如的浓度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。每个浓度放入五条鱼，可用静态。每个浓度放入五条鱼，可用静态方式进行，不设平行组，试验持续方式进行，不设平行组，试验持续4896h。每日至。每日至少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。求少两次记录各容器内的死鱼数，并
13、及时取出死鱼。求出出24h100死亡浓度和死亡浓度和96h无死亡浓度。无死亡浓度。如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。4 2正式实验正式实验 根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和低浓度和96 h鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置5个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应2.2。每个试验浓度组应至少设每个试验浓度组应至少设23个平行，
14、每一系列设个平行，每一系列设一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组，一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组，其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以每组实验浓度每组实验浓度1020尾合适，不得少于尾合适，不得少于10尾。尾。试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随即取试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随即取出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应的鱼均应弃除。同一试验，所有试验用鱼应30min内分内分组完毕。组完毕。4 在在2
15、4h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。应在试验开始后死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h或或6h观察各处理组观察各处理组鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积、受惊吓后运平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积、受惊吓后运动状况等）。动状况等）。
16、试验开始和结束时要测定试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期、溶解氧和温度。试验期间，每天至少测定一次。间，每天至少测定一次。至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的受试物浓度。受试物浓度。试验结束时，对照组的死亡率不得超过试验结束时，对照组的死亡率不得超过10。4 1数据处理数据处理 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出用直线内插法或常用统计程序计算出 24h、48h、72h、96h的半致死浓度（的半致死浓度（LC50）值，并计算）值，并计算95的的置信限。置信限。如果试验数据不适于计算如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死，可用不引起死亡的最高浓度和引起亡的最高浓度和引起100死亡的最低死亡浓度估算死亡的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的集合平均值。的近似值，即这两个浓度的集合平均值。5 2化学物质急性毒性分级化学物质急性毒性分级
