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2、线粒体DNA特点提取方法研究方法及其局限性应用前景一 鱼类mtDNA的特点鱼类mtDNA分子大小范围一般在1520 kb之间，约占总DNA的1。鱼类mtDNA的分子大小在种间存在差异，但这种长度差异并非源于基因数目，主要由于串联重复序列的存在。同核DNA相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。此外，部分mtDNA的密码子不同于基因组DNA，且缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。鱼类每个细胞中有100010000个线粒体DNA拷贝，容易从组织中分离纯化。鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA，为基因组DNA的5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤修复机制，修复效率低。鱼类mtD
3、NA的解码由一个很小的tRNA体系完成，而不像在核基因组摆动假说中所要求的需要在32个tRNA反密码子上的摆动。mtDNA能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tNA)和核糖体RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的。一般情况下，在一种生物机体内仅存在一种类型的mtDNA分子，但现在大量发现一些个体存在多种类型的mtDNA分子，这种特性被称mtDNA分子的异质性。多态性集中在D环，其他区域
4、则高度保守一。鳗鱼线粒体为双亲遗传二 鱼类mtDNA的提取方法（1）直接从鱼类组织提取线粒体DNA（2）先提取基因组DNA再用相应引物PCR 扩增所需mtDNA某一区域序列片段。从肌肉、肝脏等组织中提取基因组DNA，PCR扩增出mtDNA 区段根据动物基因组DNA提取的一般方法，将DNA提取缓冲液中各个成分含量进行改进，PCR引物为鲤科鱼类线粒体DNA细胞色素b通用引物。三 鱼类mtDNA研究的方法1 限制性片段长度多态nmtDNA由于大小、母系遗传方式、易于提纯和进化上的特点等，成为RFLP的最佳靶序列。但mtDNA进化速率较快，不适合于科以上种间的比较研究。目前该法应用较广泛，主要方法有以
5、下几种。其研究步骤为：mtDNA样品一RE消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品，如mtDNA和PCR扩增产物，还可进行位点比较和片段长度比较。又称杂交法。将基因组DNA酶切，用mtDNA探针进行South杂交来识别DNA上的mtDNA谱带，通过自显影检测印迹。从细胞总DNA中，用扩增mtDNA某一序列的引物作PCR，RE消化，溴化乙锭染色，电泳检测。这一技术可直接酶切小于5002 000 bp的短小片段。n2 测序法 直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列。这种方法可获得大量直接可靠的数据，但受技术条件和经费限制，难以适应大群体、大样本的分析。目前，结合PCR
6、技术，可扩增特定基因片段作测序分析，在一定程度上扩展了测序法的应用范围。mtDNA的研究方法存在局限性n PCR-RFLP法方便、快捷，对样品数量和质量的要求低，费用和时间消耗少，但终究只是对DNA序列的间接反映：而测序法虽可获得大量的较为可靠的数据，但由于技术限制和费用巨大，难以用于大群体和大样本的遗传和进化研究。而且，在实际研究中，由于统计学的缘故，基于DNA水平计算的群体基因突变率往往高于真实的情况。因而在进行鱼类分子群体遗传研究时，应将遗传结构的分析结果与生物的形态结构、生理特征和生态环境等因素综合考虑，从更多的方面寻找更多的证据，从而得出一个更加客观、系统而深入的认识。四 鱼类mtD
7、NA研究的应用前景n1 保护濒危鱼种的遗传多样性。保护生物学的中心议题是保护生物的遗传多样性。mtDNA多态分析可用来检测濒危物种的多样性程度，是对物种是否濒危及其可能的演变趋势的一种有效评估方式，在鱼类濒危物种的保护和恢复方面将发挥巨大的作用。n2 由于mtDNA母系遗传的特性，利用其母系遗传规律研究单性鱼类的来源，使得鱼类mtDNA多态分析在杂交带遗传渐渗研究中具有巨大潜力，并在进行杂种分析、揭示杂种来源方面发挥巨大作用。n3 利用鱼类mtDNARFLP分析，研究个体间的遗传多态和群体间的遗传歧异，阐明种群的遗传结构，揭示物种多样性概况，从而为解决渔政管理的核心问题 遗传多样性保护提供理论
8、依据。n4 利用mtDNARFLP分析，可以评估渔业活动对鱼类遗传资源结构的影响，检测引入种和驯化种对野生资源的影响、养殖种群对野生种群的影响及引种过程中遗传多样性的改变，从而加强对渔业活动的指导，提供科学有效的管理手段和模式。渔业活动如果是选择性的，对其中某些组分的过分捕捞势必改变整个种群的遗传结构，是造成资源衰退的一个重要原因。n5 利用mtDNA分析种内多态性，可揭示原始种群的遗传分化情况以及与地理分布的关系，这也是分子动物地理学研究的核心内容。n6 mtDNA种间多态比较分析，可作为了解物种起源与分化、明确种问系统发生关系的分子标记。n7 利用mtDNA多态分析，可计算物种或种群的分离时间，有助于解决分类中的疑难问题。
