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1、鳄鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS2019071 范围本方法规定了鳄鱼及其制品中裸盖鱼(AnOPiOPonIafimbria)、油鱼(Lepidocybiumflavobrunneum,Ruvettiispretiosus和南极犬牙鱼(DiSSoSiiChuSeleginoide$,Dissostichuamawsoni)源性成分的实时荧光PCR检测方法。本方法适用于鳄鱼、鳄鱼片、鳄鱼扒等生鲜或速冻鳄鱼产品(不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品)中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。2 原理使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测
2、的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。3 试剂和材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA防污染的容器分装。3.1 引物探针序列3.1.1 裸盖鱼源性成分股国基因裸盖鱼源成分5端引物：5AGGGACCACCCTAACATTCG-3裸盖鱼源性成分3端引物：5-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3,裸盖鱼源性成分探针：5,-fam-cAgctctcACtgActactcgcATGA-BHQ-3,312油鱼源性成分C
3、yS基因油鱼源性成分5端引物：5-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3,油鱼源性成分3端引物：5,-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3,油鱼源性成分探针：5FAM-CATCCGAAACeTTCATGCAAACGGC-BHQI-33.1.3 南极犬牙鱼源性成分基因南极犬牙鱼源性成分5，端引物：5LCTGAATATGTAGGTGCATACG-3南极犬牙鱼源性成分3，端引物：5,-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3,南极犬牙鱼源性成分探针：5,-fam-tccattaggtaagcgagcgggaaga-bhqi-3,3.1.4 1.4内参照基因真核生物18SrRNA
4、内参照5，端引物：5,-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3,内参照3端引物：5,-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3,内参照探针：5-Fam-Ccgtttctcaggctccctctccggaatcgaac-Bhq1-3,3.2 商业化DNA提取试剂盒。3.3 商业化PCR反应预混液。4 仪器和设备4.1 实时荧光PCR仪。4. 2微量紫外分光光度计。5. 3恒温水浴锅。6. 4高速冷冻离心机：离心力18,OOOg以上。7. 5微量移液器(0.5L-10L,10L-100L,20L-200L,100L-1000L)。8. 6涡旋振荡器。9. 7天平：感量
5、0.001go10. 分析步骤10.1 品前处理(1)样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。(2)样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。(3)样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。注：速冻鳄鱼产品应在完全解冻后再取样。5. 2DNA提取按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。6. 3DNA浓度测定取1LDNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDN
6、A(双链DNA)计算方式检测其浓度。5. 4实时荧光PCR扩增实时荧光PCR反应体系见表I0表1实时荧光PCR反应体系PCR预混液(2)10L10molL上游引物0.4L10molL下游引物0.4L10molL探针0.2LDNA20-50ng灭菌去离子水补充至总体积20LPCR反应程序：9515s；955s,6034s（读取荧光），40个循环。5 .5实验对照分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。阳性对照：含相应物种的DNA。阴性对照：不含相应物种的DNA。PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行DN
7、A提取。6 结果判断与表述6.1 质量控制若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Cl值30.0；阴性对照：Ct值35.O;PCR空白对照：Ct35.0;空白提取对照：Cl值235.0；内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值V30.0：样品平行反应：Ct值经6.2结果判定后应一致。6 .2结果判定（1）如Ct值V30.0,且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。（2）如Ct值30.0,且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。7 .3结果表述检出XXX源性成分。未检出XXX源性成分。8 防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。9 方法检出限裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1%5%,油鱼引物探针检出限范围为1%10%,南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1%2%.注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。本方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院。验证单位：河南省产品质量监督检验院、天津市食品安全检测技术研究院、重庆市食品药品检验检测研究院、福建省食品药品质量检验研究院、广东省食品检验所。主要起草人：林霖、张世伟、吴佳辉、王坤、杨国武、杨俊。
