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1、附件5水产品中硝基吠喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201705）1范围本方法规定了水产品中硝基吠喃类代谢物快速检测方法。本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中吠喃哇酮代谢物（AoZ）、吠喃它酮代谢物（AMoZ）、吠喃西林代谢物（SEM）,吠喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。2原理样品中硝基吠喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基吠喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中硝基吠喃类代谢物进行定性判定。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为
2、分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 盐酸。3.1.2 三水合磷酸氢二钾。3.1.3 氢氧化钠。3.1.4 甲静。3.1.5 乙醉。3.1.6 乙月乳3.1.7 邻硝基苯甲醛。3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。3.1.9 乙酸乙酯。3.1.10 正己烷。3.1.11 邻硝基苯甲醛溶液（1OmmolZL）：准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至IOomLO3.1.12 磷酸氢二钾溶液（0.Imol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2）,用水溶解并定容至100OmLo3.1.13 氢氧化钠溶液（ImolZL）：准确称39.9
3、96g氢氧化钠（3.1.3）,用水溶解并稀释至100OmLo3.1.14盐酸溶液（ImOl/L）：取IOmL盐酸（3.1.1）加入到IIOmL水中。3.1.15 三羟甲基氨基甲烷溶液（IOmmolZL）：准确称取1.2IIg三羟甲基氨基甲烷（3.1.8）,溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调PH至8.0后用水定容至1L。3.2 参考物质3.2.1 硝基吠喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1,纯度299%。表1硝基味喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量3-氨基2.恶嗖烷
4、酮3-anmino-2-oxazolidinone,AOZ80-65-9C3H6N2O2102.095-甲基吗咻-3-氨基-2-哇烷基酮5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazoIidinone5AMOZ43056-63-9C8Hi5N3O3201.221氨基2.乙内酰服盐酸盐1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD2827-56-7C3H5N3O2HCl151.55氨基肥盐酸盐Semicarbazidhydrochloride,SEM563-41-7NH2CONHNH2HCI111.53注：或等同可溯源物质。3.3 标准溶液的配制3.3.
5、1 标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0OoIg）,用乙晴溶解，配制成100mg/L的标准储备液。-20C冷冻避光保存，有效期12个月。3.3.2 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各ImL于IoomL容量瓶中，用乙懵定容至刻度，配制成浓度为lmgL的混合中间标准溶液。4冷藏避光保存，有效期3个月。3.3.3 混合标准工作溶液：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（3.3.2）于IomL容量瓶中，用乙懵定容至刻度，配制成浓度为0.0ImgzL的混合标准工作溶液。4冷藏避光保存，有效期1个月。3.4 材料3.4.1 AoZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。
6、3.4.2 AMoZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。3.4.3 SEM试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。3.4.4 AHD试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。3.4.5 固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格ImL,填装量为60mg。4仪器和设备4.1电子天平：感量分别为0.1g和0.0001g。4.3 水浴箱。4.4 离心机。4.5 氮吹仪或空气吹干仪。4.6 移液枪：10L,100L,1000L,5000Lo4.7 涡旋振荡仪。4.8 胶体金读数仪（可选）。4.9 固相萃取装置（可选）。4.10 环境条件：温度1535C,湿度W80%。5分析步骤5.1 试样
7、制备按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），用于后续实验。5.2 试样提取和净化称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至OQlg）于50mL离心管。5.2.1 方法一（液液萃取法）称取2g0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mLlmolL盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmolL邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11）,充分振荡3min；将上述离心管在60水浴下孵育60min;依次加入5mL0lmolL磷酸氢二钾溶液（3.1.12）,04mLlmolL氢氧化钠溶液（3.1.13）,乙酸乙酯6mL,充分混合3m
8、in,在室温（2025C）下4000rmin,离心5min；移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，振荡Imin,然后加入0.5mLIOmmolZL三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15）,充分混匀30s,室温下4000rmin,离心3min（或静置至明显分层）；下层溶液即为待测液。5.2.2 方法二（固相萃取法）称取6g0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mLlmolL盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmolL邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11）,充分振荡3min；将上述离心管在60水浴下孵育60min;
9、依次加入5mL0lmolL磷酸氢二钾溶液（3.1.12）,04mLlmolL氢氧化钠溶液（3.1.13）,乙酸乙酯6mL,充分混合3min,在室温（2025C）下4000rmin,离心5min；移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入IOmLl0%乙酸乙酯乙醇溶液，上下颠倒混合45次，4000rmin离心Imin（底部会有部分沉淀）。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱（3.4.5）上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除
10、干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加ImLlOmmo1/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15）。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸510次混合均匀，室温（2025C）温育5min,将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育3-6min,从微孔中取出试纸条，进行结果判定。5.3.2 检测卡测定步骤吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（2025C）温育5IOmin,直接进行结果判定。5.4质控试验每批样品应
11、同时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1 空白试验称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2 加标质控试验准确称取空白样品适量（精确至001g）置于50mL具塞离心管中，加入适量硝基吠喃类代谢物标准工作液，使其浓度为0.5gkg,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6结果判定要求结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图1和图2所示。6.1 比色法6.1.1 无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。6.1.2 阳性结果检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比
12、控制线（C线）颜色浅，表明样品中硝基吠喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。6.1.3 阴性结果检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中硝基吠喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。图1目视判定示意图（比色法）6.2 消线法6.2.1 无效控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。6.2.2 阳性结果检测线（T线）不显色，表明样品中硝基吠喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。6.2.3 阴性结果检测线（T线）与控制线（C线）均显色，表明样品中硝基吠喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。6.3 质控试验要求空白试验测
13、定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。7结论当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。8性能指标8.1 检测限:AoZ、AM0ZSEMAHD均为0.5gkg08.2 灵敏度：灵敏度应95%8.3 特异性：特异性应295%。8.4 假阴性率：假阴性率应W5%。8.5 假阳性率：假阳性率应W5%。注：性能指标计算方法见附录A。9其他本方法的测定步骤和结果判读也可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本标准参比方法为GB/T21311动物源性食品中硝基吠喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法。附录A快速检测方法性能指标计算表表A.1性能指标计算方法样品情
14、况a检测结果b总数阳性阴性阳性NllN12Nl=N1I+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11N12N.2=N21+N22N=NI.+N2.或N.1+N.2显著性差异（2）2=(N12-N21-1)2(N12+N21),自由度(df)=1灵敏度（p+,%）p+=NllNl.特异性（P，%）p-=N22N2.假阴性率（pf-,%）pf-=N12/N1=1OO-灵敏度假阳性率（pf+,%）pf+=N21N2=1Oo-特异性相对准确度，%c(Nll+N22)/(N1.+N2.)注：a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：NIl表示第一行，第一列，NL表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心验证单位：上海市食品药品检验所、山东省食品药品检验研究院。主要起草人：岳振峰，张恒，黄欣迪，李永吉，薛霞。
