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1、灭菌与消毒指示器材鉴定试验1压力蒸汽灭菌生物指示物鉴定试验1.1 目的测定压力蒸汽灭菌生物指示物所含菌量，以及在121C05C饱和蒸汽作用下的存活时间、杀灭时间与D值是否达到要求指标。1.2 实验器材(1)压力蒸汽灭菌生物指示器材抗力检测器(biologicalindicatorevaluatorresistometer,pressuredsteamsterilization,BIER,下简称抗力检测器)。对抗力检测器要求的技术指标：时间控制以秒为单位；温度控制以0.1C为单位；加热至预定温度的时间应WlOs;排气时间W5s；试验期间柜室内温度误差W0.5。(2)56oC-60oC温箱。(3)
2、澳甲酚紫蛋白腺培养液(嗜热脂肪杆菌芽胞恢复培养基，见附录A)。(4)嗜热脂肪杆菌芽胞恢复琼脂培养基(见附录A)。(5)眼科镶子(夹取菌片用)。(6)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03molL,PH7.2)。(7)回收液(含0.1%吐温80的PBS液)。1.3 生物指示物微生物含量与抗力标准(1)嗜热脂肪杆菌(Bao7/5$b仪曲切叼?相/5人丁(：7953或55131)芽抱。回收菌量为5xl(Pcfu/片51()6cfu片，或5x105cfuml5x106cfuml。(2)在121C0.5C饱和蒸汽条件下，存活时间23.9min,杀灭时间W19min(3)在C0.5C饱和蒸汽条件下，D值为1.3m
3、in1.9min1.4 生物指示物含菌量的测定随机抽取3个生物指示物样本。样本如为菌悬液式指示物，直接用PBS作适当稀释后，按2.L1.3规定进行活菌培养计数即可；样本如为含菌载体式指示物(如菌片)，应先置回收液中洗下芽抱，并以PBS稀释至适当浓度，再进行活菌计数培养。培养温度为56C6(C,24h观察结果。培养基仍用营养琼脂培养基。检测菌量符合1.3者为合格。1.5 存活时间和杀灭时间的测定下以生物指示管的测定为例：(1)试验按作用时间分为3.9min和19min两组，各组测定20个样本。(2)先将抗力检测器的电热蒸汽发生器加满蒸储水，以不超过最高水位为度。(3)接通检测器电源，预热，使达到
4、预定蒸汽压。(4)设定灭菌温度(121C0.5C)和作用时间。(5)启动抗力检测器工作程序，使自动运行两个循环，以保证柜室等得到充分的预热。(6)将生物指示管(每批放20个样本)放专用载物架上并置抗力检测器柜室中，保证每个样本都可充分暴露于蒸汽中。(7)关闭柜门，先设定一组所规定的灭菌时间。(8)启动抗力检测器工作程序，使自动进行抽真空一柜室加热一灭菌处理排气。(9)打开柜门，取出生物指示管。(10)紧接着重复(5)(9)的程序进行另一组的测定。(11)取出的生物指示管应尽快(勿超过2h)放入56C60C温箱，培养7d,观察最终结果。(12)测定结果，39min组(存活时间组)20个生物指示管
5、均有菌生长；19min组(杀灭时间组)20个生物指示管均无菌生长时，可判为合格。其中一个组或两组各有一个样本未达规定要求，可再用4组样本重复试验(3.9min和19min组各测试2次)。重复试验中，如各样本均达规定要求，仍可认为合格。对生物指示菌片测定时，操作程序与判断标准与上述生物指示管基本相同，只是将单片菌片装于牛皮纸袋中，以防灭菌时被冷凝水浸湿。此外灭菌完毕，需将样本分别接种于澳甲酚紫蛋白陈培养液中培养，7d观察最终结果.1.6 D值的测定(1)随机抽取50个样本，在Omin20min范围内分成10个作用时间组进行试验。每组5个样本。作用时间递增幅度，可根据预备试验结果适当变动(最长时间
6、必须达到使菌全部死亡的作用时间)。(2)将各组样本按1.5(2)-(10)所示程序，分次进行灭菌处理。(3)灭菌完毕，按1.4所示对各组样本随机抽取3个进行活菌培养计数。(4)计算每个作用时间样本上平均存活芽抱数的对数值。以作用时间为横坐标(X),存活芽抱数的对数值为纵坐标(Y),算出芽抱存活与作用时间的回归方程(Y=a+bX)o(5)计算各实际测定值与直线回归方程的相关程度(相关系数)。(6)根据所得直线回归方程式，计算出减少90%芽胞数所需的作用时间(D值)。D值符合1.3者为合格。1.7稳定性试验(1)在规定的贮存条件下，存放足量产品。(2)按使用说明书规定的有效期限抽样检测，先观察外观
7、，特别注意指示剂中的培养液颜色有无变化。(3)在外观正常情况下，进一步按1.4、1.5所示方法测定活菌数量、存活时间、杀灭时间。菌量数下降50%,存活时间和杀灭时间又在规定合格范围内(见1.3)者，该贮存期可视为产品的有效保存期。1.8 注意事项(1)测定生物指示剂的抗力时，必须用压力蒸汽灭菌生物指示剂检测器进行，不能用普通压力蒸汽灭菌器代替。(2)使用抗力检测器进行测定时，为确保每次加热时间的一致，每次间隔时间不宜超过100s。如时间过长，柜室必须重新预热。(3)培养基性能对热损伤后的芽泡恢复有一定影响，试验时不能用普通培养基代替恢复培养基。(4)严格无菌操作，尤其是对生物指示菌片进行存活和
8、杀灭时间测定时。2压力蒸汽灭菌化学指示卡鉴定试验2.1 目的测定下排气式、预真空式和脉动真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡(下简称化学指示卡)产品在饱和蒸汽作用下所产生的颜色变化，与拟代表的温度、杀菌作用时间的吻合情况，以作为判断该指示卡是否合格的依据。对其他相似类型化学指示物的鉴定，可参照本试验的有关原则进行。2.2 实验器材(1)压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器见1.2(1),下简称抗力检测器。(2)生物指示物(经鉴定合格者，见1)。(3)留点温度计(60C14(C,应经检定合格)。2.3 试验分组试验根据作用温度和时间分组，一般情况下，以使用说明书表明的变色温度和作用时间为第1组，而后温度不变
9、，作用时间缩短Iomin为第2组；另外，作用时间不变，仍为20min,温度下降4为第3组。预真空和脉动真空式压力蒸汽灭菌，因所需作用时间很短，故第2组只降低2min即可。例如，某一下排气式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为121C,作用20min可全部达到变色完全(与标准合格色块相同)。对该指示卡鉴定试验时，可分组如下：第1组121C,20min;第2组121C,IOmin;第3组117C,20min又如，某一预真空式压力蒸汽灭菌化学指示卡使用说明书写明，在温度为132,作用3min可全部达到变色完全。对该指示卡鉴定试验时，可分组如下：第1组1320C,3min；第2组132C,I
10、min;第3组128,3mi11o分组测试的目的是：验证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使指示卡变色完全；测试灭菌不完全的温度或时间条件下，化学指示变色不完全(未达到与标准合格色块深度相同)的比例2.4 实验室试验操作程序(1)每组试验，取10片化学指示卡、1件生物指示器材和1支留点温度计，同时放入抗力检测器中。(2)操作抗力检测器,将各组样本按1.5(2)(10)所示程序分次进行处理(各试验组要求的温度和作用时间，见2.3)。(3)立即打开柜门，取出上述物品，进行检测。(4)检测时，观察留点温度计所示温度；对比化学指示卡上变色色块与标准合格色块的颜色，确认是否达到合格要求；将生物指示物
11、放入56温箱中培养7d,并观察是否有菌生长。(5)系统记录各组留点温度计、化学指示卡和生物指示物的结果。(6)各组试验均重复3次。(7)3次测定结果均符合以下全部情况者可判为合格：第1组指示卡100%变色完全，第2组与第3组指示卡20%变色完全；各组生物指示物结果与指示卡基本同步；留点温度计读数与试验规定的温度，相差不超过0.5Co2.5 稳定性试验取包装完好并在室温、避光、干燥条件下，保存至一定时间(至少半年)的化学指示卡，用实验室试验(2.4)方法进行检测。若结果符合上述要求，可视为指示卡在该保存期内性能稳定。2.6 注意事项(1)化学指示卡的鉴定，除注意其在到达灭菌要求温度和时间时可变为
12、合格颜色外，还必须观察其在未达到灭菌要求温度和时间时是否不会变成合格颜色。从防止灭菌不合格角度看，后者更为重要。因此，在试验中低于灭菌要求温度和时间组绝不可省略。(2)测定时应使用饱和蒸汽，否则可影响结果的准确性。(3)留点温度计检定时所观测到的误差，在记录试验温度时，应将读数校正。(4)压力蒸汽灭菌生物指示物抗力检测器为一专用设备，国外和我国均有生产。由于试验要求的精密度较高，不宜用一般压力蒸汽灭菌器代替。(5)试验中所用化学指示卡和生物指示物必须为同批产品。(6)下排气式和预真空(包括脉动真空)式压力蒸汽灭菌对温度和作用时间的精确度要求不同，故在两类化学指示卡试验分组中温度和作用时间的组距
13、亦不同，两者不宜混用。(7)对所要求的重复性试验，不可只在同次试验中增加一些化学指示卡，而应每重复次试验即应进行一次压力蒸汽灭菌处理，以防产生系统性误差。3压力蒸汽灭菌化学指示胶带与化学指示标签的鉴定试验3.1 目的测定压力蒸汽灭菌用化学指示胶带与化学指示标签在规定温度的饱和蒸汽和作用时间下的变色情况，以作为判断该指示胶带和标签是否适用于作为经压力蒸汽灭菌处理标志的依据。3.2 实验器材(1)下排气式压力蒸汽灭菌器与预真空或脉动真空压力蒸汽灭菌器.(2)留点温度计(60140C,经鉴定合格)。3.3 试验分组试验根据作用温度和时间分组，一般情况下化学指示胶带和标签所要求的准确度较化学指示卡类产
14、品为宽松。分组时，以使用说明书表明的变色温度和作用时间为第1组；而后，温度不变，作用时间缩短IOmin为第2组；另外，时间不变，温度下降10为第3组。预真空和脉动真空压力蒸汽灭菌，因所需时间很短，故第2组缩短至Imin即可。例如，使用说明书表明，某种用于下排气式压力蒸汽灭菌的化学指示胶带，在温度为121C,作用20min可全部达到变色完全(与标准合格色块相同)。试验时，可分组如下：第1组121,20min;第2组121C,IOmin;第3组IllC,20min,又如，某一用于预真空与脉动真空式压力蒸汽灭菌的的化学指示胶带，说明书写明，在温度为132C,作用3min可全部达到变色完全。试验时，可
15、分组如下：第1组132C,3min；第2组132C,Imin;第3组122C,3mino分组测试的目的是：验证使用说明书所表明的温度和作用时间，能否使样本变色完全；测试灭菌不完全温度或时间条件下，化学指示胶带与化学指示标签变色不完全(未达到与标准合格色块深度相同)的比例。3.4 试验操作程序(1)每组试验取5个标签或来自不同卷的5段胶带，粘贴于厚纸片上，随同一留点温度计放入相应的压力蒸汽灭菌器中。(2)按常规灭菌方法处理，待达到要求的温度及其相应的压力，持续至规定的时间，排空柜室内蒸汽使成常压。(3)打开柜门，取出样本。(4)观察、记录化学指示胶带、标签，是否变色和留点温度计显示的温度。(5)各组试验重复3次。(6)3次试验均符合以下条件者为合格：第1组全部样本变色完全，第2和第3组变色完全的样本比例不超过20%o留点温度计所示温度与设定的温度相差不超过0.5。对未印有变色完全的标准色块的指示胶带和标签，可依据生产者另外提供的完全变色样木，对变色完全与否进行判断。3.5 稳定性试验取包装完好的样本，在室温、避光、干燥条件下保存至使用说明书规定的有效期限，用3.4规定的方
