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1、抗体制备 多克隆抗制备 单克隆抗制备动物产生抗体的机理 抗原（非自己的物质）免疫动物 激活免疫B细胞 转化成浆细胞 分泌特异性的抗体单克隆抗体制备原理-单克隆抗体杂交瘤技术基本流程 单克隆抗体的制备步骤 1.免疫原的制备：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 半抗原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体2.免疫动物 选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。50100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.
2、5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。一只兔子每次的免疫剂量：细胞抗原不低于1x107 ；可溶性抗原100ug1mg；合成抗原为2mg（半抗原约为20200ug），选用皮内、皮下、肌肉、静脉、或淋巴结内途径进行免疫，一般抗原免疫34次，合成抗原免疫6次以上，两次免疫间隔时间3周3.细胞融合 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（Sig
3、ma）作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。4.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选 细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。5.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆 阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，用包被液稀释成110ug/mL的抗原100ul/孔包被
4、ELISA板，4过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用110的脱脂奶粉或13 BSA或36牛血清封闭30-60min;加入阳性孔培养上清100ul/孔，37 12 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37 12小时，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD492的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。获分别对上述抗原有特异性反应的阳性孔。筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获对上述抗原有特异性反应的杂交瘤细胞株。细胞株进一步扩大
5、培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。阳性孔的检测杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存 杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。6.单克隆抗体腹水制备及纯化 取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4
6、.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70保存。7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定 将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA,IgG1,IgG2a,IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。ELISA方法 用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在105107之间的可用于实际应用。单克隆抗体和多克隆抗体的比较比较
7、项目多克隆抗体（PcAb）单克隆抗体（MAb）免疫原要求免疫原纯度高，抗体纯度才能高不纯的免疫原可以获得高纯度抗体抗体产生细胞多克隆性单克隆性均质性高度异质高度纯质特异性较高，与抗原上多种决定簇结合高，与抗原上特定决定簇结合稳定性较好相对较差，对理化条件敏感标准化较难，不同批次的抗体质量差异大易于标准化，批次间差异小交叉反应很常见，难避免非特异性反应不常见，可避免非特异反应沉淀反应有多数没有实用的血清学试验大多数血清学试验一种或多种，需适当选择供应量有限无限有效抗体含量0.1-0.2 mg/ml小鼠腹水2.0-30 mg/ml无效Ig含量10.0-15.0 mg/ml体外培养一般没有，小鼠腹水
8、0.5-5.0 mg/ml其它血清蛋白存在体外培养可能有少量小牛血清蛋白，小鼠腹水有少量杂蛋白免疫技术 原理：抗体与抗原表位的特异性结合反原理：抗体与抗原表位的特异性结合反应，并利用酶与底物的显色反应、金颗应，并利用酶与底物的显色反应、金颗粒、同位素、荧光素来间接显示粒、同位素、荧光素来间接显示常见的几种免疫技术 酶联免疫吸附测定法（酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）1971年Engvall和Perlman 第一次建立了 ELISA检测方法，使对抗原和抗体的检测和定量可以通过简单的颜色反应实现（Engvall&Perlman，1
9、971），是目前检测中应用得最多的方法，它把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起。与其他血清学方法相比，该方法具有灵敏度高（1-20 ng）、操作简单、特异性好、安全并可同时检测大批量样品的优势。自从ELISA方法建立之后，在应用于植物病毒的检测过程中又有了很多的改进。介绍常用的几种ELISA方法。常用的几种ELISA方法 1）直接ELISA：待测抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特异性的酶-特异性抗体偶联物。因为所用的酶已经标记在特定的抗体上，可检测的病毒种类只能局限于某一种。2）间接ELISA：待测抗原直接包被微量滴定板，然后加入特异性抗体，再加入酶标抗体。与直接E
10、LISA相比，间接ELISA适用的范围更为广泛，并且特异性也较好。3）夹心ELISA：使用俘获抗体（包括单抗和多抗）包被微量滴定板，其余步骤同间接ELISA。根据包被抗体种类的不同，又可以分为同种单抗夹心ELISA，异种单抗夹心ELISA，多种单抗混合夹心ELISA和多抗夹心ELISA等几种方法。与间接ELISA相比，夹心ELISA多了一步以抗体俘获富集抗原的过程，因而其灵敏度和特异性也相应提高。但是对有些病毒的株系，夹心ELISA并不是很好的选择。这可能与单克隆抗体识别的是蛋白亚基的抗原表位还是病毒粒子表面的抗原表位有关。免疫印迹检测（免疫印迹检测（Immunoblotting assays
11、）利用蛋白与硝酸纤维素膜或尼龙膜有很强的结合能力的特点，将经过电泳分离的蛋白从胶上转移到膜上或者直接将蛋白点到膜上，经过类似ELISA的反应，蛋白会被特异的抗体检测。主要可以分为以下几种方法：1）Western印迹（Western blot）：Western blot是基于电泳和血清学的技术，将电泳分离蛋白的能力和血清学反应的特异性结合起来，能够检测含量极少的蛋白。因此检测的灵敏度极高。2）斑点免疫印迹（Dot-blot immunoassay,DBIA）：在DBIA中将样品悬浮液（1-5 l）点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上晾干。其余步骤同Western blot。在检测少量样品时比ELISA具有
12、优势：所需试剂少，不需特别的仪器，省时，具有与ELISA相同的灵敏度。3）组织免疫印迹（Tissue-blot immunoassay,TBIA）：TBIA是检测感病植物的更为简单的方法。直接将新鲜样品的切割面印记到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后按照DBIA的程序进行，可靠性和灵敏度与DBIA和ELISA相似。特别适合检测大量样品。Western blot 实验步骤 1.SDS-PAGE 蛋白电泳 2.转膜 3.封闭 4.一抗反应 5.洗膜 6.二抗反应 7.洗膜 8.底物现色 9.中止反应免疫胶体金技术（免疫胶体金技术（immuno-colloidal gold technology）胶体金颗粒以
13、静电、非共价键方式吸附抗体分子，而形成稳定的IgG-胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合，抗体胶体金复合物就可以结合在抗原上。通过光学显微镜、透射电镜确定病毒的复制部位或病毒产物的存在部位，亚细胞结构的定位。也有将免疫斑点检测中的酶标抗体换成胶体金标记抗体，因不需要酶促反应的底物，所以进一步缩短了反应的时间。免疫捕获反转录免疫捕获反转录PCR（Immunocapture reverse transcript PCR,IC-RT-PCR）当PCR技术在生物学领域迅速发展起来之后，也被用于植物病毒的检测，但是大多数植物病毒为RNA病毒，要进行检测和鉴定还需要抽提RNA和反转录合成cDNA的过程，而
14、1990年Jansen等（1990）建立了IC-RT-PCR检测方法，它将免疫学检测技术和分子生物学检测技术有机的结合起来，并且用于多种植物病毒的检测（Pasquini et al.,1998;Hema et al.,2003）。与单纯的PCR检测相比，它能提高检测的特异性，减小污染的可能，而且省却了提取RNA的步骤，降低了检测的成本，是一种快速有效的方法。与ELISA检测相比，可以直接从病汁液中捕获病毒粒子，起到了浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度。Jacobi等比较了ELISA和IC-RT-PCR对ToMV的检测灵敏度，结果IC-RT-PCR的检测极限可达到10-100 fg ml1，而ELISA方法只有1ng ml-1（Jacobi et al.,1998）。其它免疫技术 放射免疫技术 免疫荧光技术 免疫共沉淀技术
