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1、2023-11-11第一节第一节 实验室设计实验室设计 v 在进行植物组织培养工作之前，首先应在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。或新建、改建实验室。2023-11-12v实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模：1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。会限制生产影响效率。2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程在设计组织培养实验室时，
2、应按组织培养程序来设计序来设计 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。v 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。养条件。2023-11-13 标准的组织培养实验室包括：标准的组织培养实验室包括：洗涤室 配置室 灭菌室 通用实验室 观察室 接种室 培养室 2023-11-14v1.洗涤室洗涤室 器具的洗涤、干燥、消毒。v2.配置室配置室 进行药品的
3、保存、配置、消毒、分装 等。v3.灭菌室灭菌室 培养基及使用器具的消毒与灭菌v4.接种室接种室 进行材料的接种，内置超净工作台或v 接种箱。外设缓冲间,放置拖鞋、v 工作服、工作帽等。v5.培养室培养室 将接种的材料进行无菌培养生长的 场所 v6.细胞学观察实验室细胞学观察实验室 进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等 2023-11-15v。准备室准备室缓冲间缓冲间(过渡室过渡室)接种室接种室(外设缓冲间外设缓冲间)培养室培养室2023-11-16 （一）仪器设备（一）仪器设备 1.超净工作台超净工作台(cleaning table):用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和
4、照明灯组成）。超净台分水平式和垂直式二种型号 2.高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）高压灭菌锅（手提式、立式或卧式）用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌锅。2023-11-17高压灭菌锅高压灭菌锅手提式灭菌锅手提式灭菌锅超净工作台超净工作台2023-11-18 3.恒温培养箱恒温培养箱:用于植物材料的培养，其用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。生化培养箱还配有光照装置。4.电子分析天平和托盘天平：电子分析天平和托盘天平：电子分析天电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维
5、生素、平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品激素等微量药品,精确度为精确度为00001g；托盘；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。的天平操作台上。2023-11-19电子天秤电子天秤培养箱培养箱2023-11-110 5.酸度计：酸度计：组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH值时，待测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量
6、时要调整pH值计上的温度扭使之和培养基温度相当。6.烘箱：烘箱：用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80-100；进行干热灭菌需保持150，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。2023-11-1112023-11-112v 7.培养架：培养架：放置培养材料。v 8.紫外线杀菌灯紫外线杀菌灯：杀菌。v 9.不锈钢托盘：不锈钢托盘：v 10.定时器：定时器：控制光照时间。v 11.普通冰箱：普通冰箱：主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等v 12.大型工作台大型工作台:其高度应方便配制工作。v 13.药品柜药品柜:用
7、于放置常用药品。v 14.解剖镜：解剖镜：种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。2023-11-113 1镊子类镊子类(forceps)常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型 2剪刀类剪刀类(scissors)可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。2023-11-114 3.解剖刀解剖刀:切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。4.解剖针解剖针:解
8、剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。5.接种盘接种盘:2023-11-115 组培瓶（玻璃）组培瓶（玻璃）-要求透光度好，能耐高压高温,以试管、三角瓶、培 养皿等使用较多。v三角锥瓶三角锥瓶-适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。v培养皿培养皿-适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。v试管试管-适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选 用。2023-11-116v 培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶.v 培养容器和制备培养基所需的玻璃器
9、皿逐培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点 v 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。污染。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸.也可采用专用的封口膜。2023-11-117v 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿.v 包括各种型号的烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、酒精、玻璃棒、滴瓶等等。2023-1
10、1-118（四）其他（四）其他 吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、卫生药棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸、洗瓶2023-11-1192023-11-12022023-11-1212023-11-1222023-11-1232023-11-1242023-11-1252023-11-1262023-11-1272023-11-1282023-11-1292023-11-1302023-11-1312023-11-1322023-11-1332023-11-1342023-11-1352023-11-1362023-11-1372023-11-1382023-11-1392023-11-14
11、0v 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组培苗的生长和发育。2023-11-141 温度是植物组织培养中的重要因素，大多数植物组织培养在2327之间进行，一般采用252。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同。白鹤非的最适温度是20、月季是2527、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在12以下，33以上形成率皆最低。2023-11-142 不同培养目标采用的培养温度不同：v 百合鳞片在30
12、以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25 以下的高。v 桃胚在2条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。v 用35处理草莓的茎尖分生组织3d，可得到无病毒苗。2023-11-143 组织培养中光照也是重要的条件之一，光强 主要表现在 光质 光照时间 2023-11-1441、光照强度（、光照强度（light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。光照强度：1000lx1500lxv黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖v光照条件：利于器官的分化 百合原球茎：黑暗下长出小球茎，光照下长出
13、叶片2023-11-1452、光质（、光质（light wave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，十几周后才出现愈伤组织；而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细；杨树愈伤组织生长红光促进，而蓝光则阻碍。2023-11-1463、光周期（、光周期（light period)试管苗培养时要选用一定的光周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄茎切段
14、培养物在短日照下才能形成根；反之，对日照长度不敏感的品种则在任何光周期下都能生根。2023-11-147 三、湿度（三、湿度（humidity)湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件。a.容器内湿度水平主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应当适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。2023-11-148v b.环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%-80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的
15、方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。2023-11-149 四、渗透压（四、渗透压（penetrating pressure)培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5-6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。2023-11-150 五、五、PH值值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在56.5左右，一般培养基皆要求5.8，这
16、基本能适应大多数植物培养的需要。PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。2023-11-151不同植物的最适不同植物的最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 种类种类 最适最适PH值值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越橘 4.5 胡萝卜 6.0 石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄、葡萄 5.72023-11-152 以硝态氮硝态氮作氮源比以铵态氮铵态氮作氮源PH值较小一些。一般来说PH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值）因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。PH值大小调节可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCl可使PH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。2023-11-153 六、气六、气 体（体（gas)v 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。v 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。v 培养室要经
