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1、 1 1、概念、概念色谱法色谱法(Chromatography(Chromatography），），也称色层法或也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。连续多次分配，从而彼此分离。色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。2 2、色谱过程、色谱过
2、程 3 3、色谱方法的共同特点：、色谱方法的共同特点：色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对 运动。运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。4 4、样品在分离时的两个基本点：、样品在分离时的两个基本点：混合物中不同组分在柱内的差速迁移混合物中不同组分在柱内的差速迁移同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散1
3、 1、按两相物理状态分类：、按两相物理状态分类：用气体作流动相用气体作流动相气相色谱气相色谱用液体作流动相用液体作流动相液相色谱液相色谱固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要色谱类型：要色谱类型：l气固色谱（气固色谱（gas-solid chromatography,GSC）l气液色谱气液色谱（gas-liquid chromatography,GLC）l液固色谱液固色谱（liquid-solid chromatography,LSC)l液液色谱液液色谱（liquid-liquid chromatography,LLC （1 1）柱层析）柱层析(co
4、lumn chromatography)column chromatography)固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。柱层析。（2 2）平板层析）平板层析(planar chromatography)planar chromatography)固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定
5、相直接制成薄板状，称为薄层层析膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)(TLC)；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析析(PC)(PC)。（1 1）吸附层析）吸附层析(absorption chromatographyabsorption chromatography)用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。固吸附层析和液固吸附层析。（2 2）分配层析）分配层析(par
6、tition chromatography)partition chromatography)用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析，液液分不同将样品组分分离。如气液分配层析，液液分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为正相层析和反相层析。对极性不同，又分为正相层析和反相层析。l正相分配层析正相分配层析 （NPC)NPC)一般以强极性、亲水性物质或溶液为
7、固定相，非极一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。l反相分配层析反相分配层析 （RPC)RPC)以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。（3 3）离子交换层析）离子交换层析 ion-exchange ion-exchange chromatographychromatography（4 4）凝胶层析）凝胶层析 gel chromatographygel chromatogra
8、phy（5 5）亲和层析）亲和层析 affinity chromatographyaffinity chromatography l生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混合物、复合物）存在，对环境如温度、合物、复合物）存在，对环境如温度、pH pH 条件、离条件、离子强度的要求较高。子强度的要求较高。l用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。性和严格的构象。层析法的优点层析法的优点1 1、在室温下操作、在室温下操作2 2、流动相的、流动相的pH pH 值可以与生理液相似值可以与生理
9、液相似选用含盐的选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂3 3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离提供了温和的条件和生物大分子的分离提供了温和的条件和 “软接软接触触”，利于保持其原有的构象和生理活性。，利于保持其原有的构象和生理活性。4 4、样品量可多可少，可用于制备和分析。、样品量可多可少，可用于制备和分析。一、常用术语一、常用术语1.1.固定相：固定相：层析基质层析基质2.2.流动相：流动相：洗脱剂、展层剂洗脱剂、展层剂3.3.层析：层析：样品在固定相和流动样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸
10、附相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终使各组分得或交换作用，最终使各组分得到分离。到分离。4.4.操作容量：操作容量：在特定条件下，在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分一般以每克基质结合某种成分的的mmolmmol数或数或mgmg数表示。数表示。固定相固定相流动相流动相5.5.床体积：床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积（积（VtVt）。）。6.6.洗脱体积：洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达
11、到最大值时流动相的体积。中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。7.7.膨胀度：膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（体积（V V）。）。8.8.分配系数和迁移率分配系数和迁移率K 在固定相中的含量在固定相中的含量在流动相中的含量在流动相中的含量Rf 在固定相中移动的距离在固定相中移动的距离在流动相中移动的距离在流动相中移动的距离外水体积外水体积 VoVo洗脱体积洗脱体积 VeVe固定相固定相层析床层析床床体积外水体积床体积外水体积基质体积内水体积基质体积内水体积 Vt Vt Vo Vo Vg Vg Vi Vi 生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的生物大分子
12、在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合可逆性结合,在洗脱剂（流动相）的作用下，在洗脱剂（流动相）的作用下，通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。差异而达到分离。吸附剂的性质吸附剂的性质洗脱剂的性质洗脱剂的性质层析柱及装填技术层析柱及装填技术对样品的要求对样品的要求加样方式及加样量加样方式及加样量柱效柱效 选择性好选择性好对不同物质的吸附力差异性大对不同物质的吸附力差异性大表面积大表面积大增加吸附容量增加吸附
13、容量性质稳定性质稳定不与被分离物、洗脱剂及溶剂发不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破碎。碎。颗粒均匀、表面积大颗粒均匀、表面积大成本低廉成本低廉 1 1、选择原则、选择原则 2 2、常用吸附剂的特点、常用吸附剂的特点l羟基磷灰石：性质稳定、吸附容量大、适用范围羟基磷灰石：性质稳定、吸附容量大、适用范围广广l硅胶：化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含硅胶：化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含水量关系密切（含水量高，活性小）水量关系密切（含水量高，
14、活性小）极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。溶剂：溶解样品的溶液溶剂：溶解样品的溶液洗脱液：洗脱吸附柱的溶液洗脱液：洗脱吸附柱的溶液选择时，从样品组分的溶解度、吸附剂的性选择时，从样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大，质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，然后换用
15、极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸附柱中洗出。附柱中洗出。1 1、概念、概念性质稳定：性质稳定：不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩纯度高：纯度高：防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形成的污染成的污染能较完全洗脱下所分离的成分能较完全洗脱下所分离的成分低粘度：低粘度：高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降低效率低效率样品容易回收样品容易回收无吸收背景：无吸收背景：提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度1 1、层析柱、层析柱吸附层析柱一般吸附层析柱一般 d:h 1:10d
16、:h 1:101:401:402 2、吸附剂用量、吸附剂用量为分离样品的为分离样品的 30 30 50 50 倍倍3 3、柱子的装填、柱子的装填干装与湿装干装与湿装l样品的溶解度好样品的溶解度好l加入的样品量利于提高分辨率加入的样品量利于提高分辨率加样量加样量 VtVt Vt Vt。l样品的浓度与粘度的考虑样品的浓度与粘度的考虑 21011注意：加样时避免冲动基质注意：加样时避免冲动基质流速太慢，流速太慢，前峰拖尾与前峰拖尾与后峰相连后峰相连流速太快，流速太快，组分分不开组分分不开正常的正常的流速使流速使组分完组分完全分离全分离l装填层析柱装填层析柱l柱的平衡柱的平衡l加样加样l洗脱洗脱l收集收集l测定测定l绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线l合并有效成份合并有效成份l计算含量（酶活力）计算含量（酶活力）l基质的再生基质的再生八、操作程序八、操作程序一、原理：一、原理：将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。层，达到分离、纯化、制备、分
