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1、细胞坏死和细胞凋亡细胞坏死(necrosis)细胞凋亡(Apoptosis)细胞坏死细胞坏死l起因l形态改变及原因物理因素：强酸、强碱、有毒物质等化学因素：热、辐射生物因素：病原体自溶异溶细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的过程分子调控机理细胞凋亡的过程分子调控机理一、细胞凋亡的概念及其生物学意义一、细胞凋亡的概念及其生物学意义概念：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外
2、界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用：蝌蚪尾的消失(图)，脊椎动物的神经系统的发育（图），发育过程中手和足的成形过程（图）。细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的形态学和生物化学特征 细胞凋亡与坏死(necrosis)细胞凋亡的形态学特征 细胞凋亡的生化特征 诱导细胞凋亡的因子二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细
3、胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应(图)凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起（图），逐渐形成单个的凋亡小体 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化 (动画)细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders(图)凋亡细胞组织转谷氨
4、酰胺酶tTG （tissue Transglutaminase）积累并达 到较高水平物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等三、细胞凋亡的过程分子调控机理细胞凋亡的过程分子调控机理线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进 细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制 细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Ca
5、spase1细胞凋亡的过程及机理Caspase家族与凋亡Caspase家族Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即CaspaseCaspase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接
6、蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域
7、；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3Bcl-2、线粒体与细胞凋亡哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另 一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端 片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源 物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋
8、亡a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜)c 凋亡细胞(透射电镜)细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞DNA电泳图电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker （自赵允、翟中和）1031个细胞，131个细胞凋亡找到一系列与细胞凋亡有关的基因:ced-3、ced-4 诱发、启动凋亡ced-9 抑制凋亡 ced-3、ced-4 基因突变或缺失，使凋亡受阻 移入 ced-9 使凋亡受阻 失去 ced-9 使细胞凋亡凋亡的启动阶段 细胞凋亡的膜受体通路 细胞色素c释放和Caspases激
9、活的生化途径凋亡的执行阶段 Caspase家族的特征 Caspase活化机制 Caspase效应机制细胞凋亡的调节Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域（Death domain，DD）的胞内区。Fas的配体FasL（Fas ligand）与Fas结合后，Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD（Fas associated death domain）的DD区结合，而后FADD的N端DED区（death effector domain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合，形成DISC(death-inducing signaling comple
10、x)，引起caspase-8、10通过自身剪激活，它们启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。细胞凋亡的启动阶段：1）细胞凋亡的膜受体通路：（以Fas-FasL为例）细胞凋亡的启动阶段：2）细胞色素c释放和Capases激活的生物化学途径释放到胞浆的细胞色素c在dATP存在的条件下，能与凋亡Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1凋亡酶激活因子-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的
11、caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。l1）C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。l2）通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000（29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。l3）末端具有一个小的或大的原结构域。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位
12、点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。Caspase活化基本有两种机制，即同源活化和异源活化，这两种活化方式密切相关，一般来说后者是前者的结果。发生同源活化的Caspase又被称为启动caspase（initiator caspase），包括caspase-8,-10,-9，诱导凋亡后，起始Caspase通过adaptor被募集到特定的起始活化复合体，形成同源二聚体构像改变，导致同源分子之间的酶切而自身活化，通常caspase-8,10,2介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到Fas和TNFR1死亡受体
13、复合物，而Caspase-9参与线粒体通路的细胞凋亡，则被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1组成的凋亡体（apoptosome）。同源活化是细胞凋亡过程中最早发生的capases水解活化事件，启动Caspase活化后，即开启细胞内的死亡程序，通过异源活化方式水解下游Caspase将凋亡信号放大，同时将死亡信号向下传递。异源活化（hetero-activation）即由一种caspase活化另一种caspase，是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径。被异源活化的Caspase又称为执行caspase(executioner caspase)，包括Caspase-3,-6,-7。执行Casp
14、ase不象启动Caspase，不能被募集到或结合起始活化复合体，它们必须依赖启动Caspase才能活化。l1)凋亡抑制物 正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不出现DNA断裂，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如果抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化（fragmentation）。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。因而，在正常情况下，CAD不显示活性是因为CAD-ICAD，以一种无活性的复合物形式存在。ICA
15、D一旦被Caspase水解，即赋予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即产生.l2)破坏细胞结构 Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamina）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase在一个近中部的固定部位所裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。l3)调节蛋白丧失功能 Caspase可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构。其中包括凝胶原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focal adhesion kin
16、ase,FAK）、P21活化激酶（PAK）等。这些蛋白的裂解导致其活性下降。如Caspase可裂解凝胶原蛋白而产生片段，使之不能通过肌动蛋白（actin）纤维来调节细胞骨架。所有这些都表明Caspase以一种有条不紊的方式进行“破坏”，它们切断细胞与周围的联系，拆散细胞骨架，阻断细胞DNA复制和修复，干扰mRNA剪切，损伤DNA与核结构，诱导细胞表达可被其他的细胞吞噬的信号，并进一步使之降解为凋亡小体。l1.凋亡抑制分子：1）p53 是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡。2）FLIPs(FLICE-imhibirory proteins)能抑制Fas/TNFR1介导的细胞凋亡。FLIPs通过DED功能区，与FADD和Caspase-8，10结合，拮抗它们之间的相互作用，从而抑制Caspase8，10募集到死亡受体复合体和它们的起始化。3）凋亡抑制蛋白（IAPs,inhibitors of Apoptosis protien）它们主要抑制Caspase3,-7，而不结合它的酶原，对Casp
