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1、基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating2023年年11月月22日日20时时16分分12023年年11月月22日日20时时16分分2The Significance of Gene Manipulating in Medical Develapments基因操作技术在医学方面的价值主要包括：基因操作技术在医学方面的价值主要包括：（1）疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；（5）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物 活性蛋白质、细胞、器官。活性蛋白质、细胞、器官。（
2、2）建立新的疾病诊断方法建立新的疾病诊断方法-基因诊断；基因诊断；（4）纠正人类基因缺陷的方法）纠正人类基因缺陷的方法-基因治疗；基因治疗；（3）发展出新的法医学鉴定方法）发展出新的法医学鉴定方法-法医学鉴定；法医学鉴定；2023年年11月月22日日20时时16分分32023年年11月月22日日20时时16分分4一、疾病相关基因分析一、疾病相关基因分析 要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。析基因的结构和疾病状态下基因的突变。19
3、11年年Wilson将将红绿色盲基因红绿色盲基因首次定位到首次定位到X染染色体色体上，开创了人类基因定位的先河。上，开创了人类基因定位的先河。1968年年Donahue利用系谱分析将利用系谱分析将Duffy血型基血型基因因定位于定位于1号染色体号染色体上，这是人类首次将基因定位于上，这是人类首次将基因定位于常染色体上。常染色体上。2023年年11月月22日日20时时16分分5 20世纪世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相年代以前，可进行结构分析的疾病相关基因仅限于个别关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产功能异常非常明确，基因表达产物纯化较易物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病
4、如的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如镰刀状贫血、地中海贫血等。镰刀状贫血、地中海贫血等。20世纪世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术年代中期以后，随着分子生物学技术的发展，尤其是的发展，尤其是重组重组DNA技术技术水平的提高和水平的提高和PCR技技术术的广泛应用，使的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆疾病相关基因的鉴定与克隆工作工作得以迅速发展。得以迅速发展。2023年年11月月22日日20时时16分分6（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病基因。实际上是利用纯化蛋白克隆
5、致病基因。基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。u获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：获取部分氨基酸序列，推导出获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成序列，合成 寡核苷酸探针，筛选寡核苷酸探针，筛选 cDNA 文库；从基因组文库文库；从基因组文库 获取其基因组序列。获取其基因组序列。制备特异性抗体，筛选表达型制备特异性抗体，筛选表达型cDNA文库。文库。只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。2023年年11月月22日日20时时16分分7u根据根据mRNAmRNA表达差异来克隆疾病相关基因：表达差异来克
6、隆疾病相关基因：（1 1）削减杂交）削减杂交(subtractive hybridization)(subtractive hybridization)（2 2）差异显示（）差异显示（differential displaydifferential display）PCRPCR（3 3）基于）基于PCRPCR的削减杂交法的削减杂交法 将正常与异常的同一组织的将正常与异常的同一组织的mRNA或或cDNA文文库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；能很灵敏地扩增两个能很灵敏地扩增两个mRNA样品中有差异的片样品中有差异的片段，克隆后进行分析；段，克隆后进行分析；将前
7、两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏将前两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏度低，差异显示度低，差异显示PCR假阳性高的缺点。假阳性高的缺点。2023年年11月月22日日20时时16分分8缺点：缺点：大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也知之不多。知之不多。不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与mRNA的的“正常正常”差异很难与特异性差异区别。差异很难与特异性差异区别。功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低，功能性克隆技术成熟、方法直接
8、、费用较低，迄今仍是克隆基因的首选策略。迄今仍是克隆基因的首选策略。优点：优点：2023年年11月月22日日20时时16分分9（二）定位克隆（二）定位克隆（positional cloning）从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆包含：系统的定位克隆包含：遗传学分析：遗传学分析：分子生物学分析：分子生物学分析：包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基因的染色体定位；因的染色体定位；包括染色体异常（缺失、易位等）分析和基因包括染色体异常（缺失、易位等）分析和
9、基因文库的筛选与基因克隆。文库的筛选与基因克隆。2023年年11月月22日日20时时16分分10杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良(DMD)致病基因的克隆：致病基因的克隆：首先，遗传学的家族连锁分析确首先，遗传学的家族连锁分析确定了致病基因位于定了致病基因位于Xp21（性（性染色体染色体X短短臂第臂第2区第区第1条带条带）。）。将病人的将病人的Xp21 DNA与正常人的杂与正常人的杂交，从而减掉了相同的基因序列，最后交，从而减掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即为病人缺失的基因。剩余的序列即为病人缺失的基因。2023年年11月月22日日20时时16分分11新的技术新的技术非定位候选基因克隆策略非定位
10、候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)：定位候选基因克隆策略定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches)：直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种基因产物功能的了解预测出候选致病基因。基因产物功能的了解预测出候选致病基因。一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定出候选致病基因。出候选致病基因。2023年年
11、11月月22日日20时时16分分12（三）基因结构和产物功能的分析（三）基因结构和产物功能的分析利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。获得未知基因后可进一步进行下列工作：获得未知基因后可进一步进行下列工作：1 1克隆和分析全长克隆和分析全长cDNAcDNA序列：序列：根据根据cDNA序列推出序列推出该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；2 2克隆基因全序列：克隆基因全序列：分析存在的内含子，启动子分析存在的内含子，启动子以及其调节位点，探讨
12、基因表达调控方式；以及其调节位点，探讨基因表达调控方式；3 3确定基因在的位置和拷贝数：确定基因在的位置和拷贝数：染色体中定位多染色体中定位多用原位杂交法，拷贝数可用用原位杂交法，拷贝数可用Southern杂交法确定。杂交法确定。2023年年11月月22日日20时时16分分134 4基因表达谱分析：基因表达谱分析：该基因在不同组织、细胞的表该基因在不同组织、细胞的表达状态。达状态。Northern blotting和点阵杂交检测和点阵杂交检测mRNA的的水平。水平。Western blotting检测蛋白质的表达。检测蛋白质的表达。5 5基因表达产物的功能分析：基因表达产物的功能分析：（1）找
13、已知功能的同源蛋白或同源结构域。）找已知功能的同源蛋白或同源结构域。（2）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。（3）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。（4）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互 作用的蛋白分子或核酸。作用的蛋白分子或核酸。2023年年11月月22日日20时时16分分14二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 基因工程技术的发展在医学上最重要的成就表基因工程技术
14、的发展在医学上最重要的成就表现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白质，或自然界本不存在的蛋白质。质，或自然界本不存在的蛋白质。克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。2023年年11月月22日日20时时16分分15生物安全性：生物安全性：活性的可控性：活性的可控性：
15、资源和生产成本：资源和生产成本：未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的生长激素、人血生长激素、人血VIII因子的副作用。因子的副作用。基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：产品名称产品名称适应症适应症乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原人胰岛素人胰岛素生长激素生长激素组织肝淳蛋白激活物（组织肝淳蛋白激活物（TPA）-干扰素干扰素-干扰素干扰素-干扰素干扰
16、素促红细胞生成素促红细胞生成素（EPO）*粒细胞刺激因子（粒细胞刺激因子（GSF）粒细胞粒细胞-巨噬细巨噬细胞刺激因子（胞刺激因子（GMSF）*表表皮生长因子（皮生长因子（EGF）第第VIII因子因子第第IX因子因子白细胞介素白细胞介素2（IL-2）白细胞介素白细胞介素3（IL-3）白细胞介素白细胞介素4（IL-4）干细胞生长因子（干细胞生长因子（SCF）抗抗CD3抗体抗体CAMPATH-1HCAMPATH-1H（淋巴细胞抗体）（淋巴细胞抗体）抗内毒素抗体抗内毒素抗体抗肿瘤坏死因子抗体抗肿瘤坏死因子抗体注射疫苗用于预防乙型肝炎注射疫苗用于预防乙型肝炎糖尿病糖尿病垂体功能低下垂体功能低下急性心肌梗塞急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并发乙型肝炎，艾滋病人并发kaposis肉瘤肉瘤多发性硬化（试用）多发性硬化（试用）抗抗贫血贫血*肾性贫血肾性贫血化化疗后白细胞和内体骨髓移植再疗后白细胞和内体骨髓移植再生生*严重烧伤严重烧伤血友病血友病A，B血友病血友病A，B肿瘤免疫治疗肿瘤免疫治疗化疗后促进髓母细胞形成化疗后促进髓母细胞形成免疫缺陷病，肿瘤，免疫佐剂
