血清学诊断在结核病中的临床应用价值.ppt

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1、Clinical Applications of Serological Diagnostics in Tuberculosis血清学检测在结核病中的血清学检测在结核病中的诊断价值诊断价值结核病的历史 纪元前一万年纪元前一万年 纪元前纪元前500500年年 汉唐隋时代汉唐隋时代 1650年年 命名结命名结核核1865年年 证实结核证实结核病具有传病具有传染性染性 1882年年 发现发现结核结核菌菌1921年年 卡介苗卡介苗1944年年 1908年年 结核菌结核菌素皮试素皮试链霉素链霉素1952年年 异烟肼异烟肼1966年年 利福平利福平1971年年 短程化短程化疗疗1995年年 DOTS策略策

2、略STOP TB策略策略2005年年 结核病的今天全球范围内结核病疫情急剧恶化全球范围内结核病疫情急剧恶化 结核病与艾滋病同时流行结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐药现象益发严重结核菌耐药现象益发严重 人口大规模流动人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 结核菌感染率结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者新发活动性结核患者130万万/年年 死亡死亡13万万/年年早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键 常规实验室诊断结核病方法阳性率不到常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%结核病的数字结核病的数字

3、全世界约全世界约1/3的人口(近的人口(近20亿)亿)携带结核菌。携带结核菌。自自1882年以来已经有年以来已经有2亿人亿人死于死于结核病。结核病。每年有每年有2000万人万人患活动性结核病。患活动性结核病。每年约有每年约有300万人万人死于结核病。死于结核病。结核病每结核病每15秒钟秒钟就杀死就杀死1人。人。预计未来预计未来20年还将有年还将有3600万人万人死死于结核病。于结核病。结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点:生物学主要特点:1.细胞壁中含有大量脂质细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性,并伴肉芽肿引起的疾病都呈慢性,并伴肉芽肿3.

4、抗酸染色阳性抗酸染色阳性实验室检查方法的历史实验室检查方法的历史1880sTubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test(TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative(PPD)1930sLewenstein-Jensen 培养基1940sDubos agar,Ogawa 培养基1950sMiddlebrook 7H91990s核酸扩增方法2000sELISPOT,QuantiFERON20XX?当前结核研究的热点当前结核研究的热点 新型抗

5、结核药物新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗新型结核疫苗(10%)结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断 细菌学细菌学涂片:涂片:敏感性低敏感性低传统固体培养:传统固体培养:所需时间长,所需时间长,23月月 分子生物学分子生物学TB-DNATB-RNAHAIN技术技术Xpert MTB/RIFDNA微阵芯片微阵芯片 血清血清/免疫学免疫学IGRA:有望替代有望替代TST,但,但不能区分不能区分活动性活动性TB与潜伏感与潜伏感染染血清学:血清学:存在抗原存在抗原纯度和特纯度和特异性差等异性差等方面的问方面的问题题液体培养及药液体培养及药敏试验:平均敏试验:

6、平均时间时间20天天血清学诊断技术血清学诊断技术血清学诊断技术优势:是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。血清学诊断技术优势:是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。l 无需活细胞培养和特殊仪器设备无需活细胞培养和特殊仪器设备l 操作简便操作简便l 结果显示快速结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法目前用于血清学诊断的主要方法:l 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELlSA)l 斑点金免疫渗滤法斑点金免疫渗滤法(DIGFA)l 免疫印迹法免疫印迹法(Western Blotting)等等等等脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分,是属特异性抗原,具脂阿拉伯

7、甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分,是属特异性抗原,具有较强的免疫原性和免疫调节功能,可刺激机体产生相应的抗体,因而是结有较强的免疫原性和免疫调节功能,可刺激机体产生相应的抗体,因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。核病的血清学诊断应用较广的抗原。有关有关LAM抗原的应用报道很多抗原的应用报道很多,Antunes等用美国生产的结明等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%,特异性为,特异性为92.4%,认为检,认为检测测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。A60(a

8、ntigen 60)A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质,是脂质蛋白和多是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质,是脂质蛋白和多糖的复合抗原。糖的复合抗原。Wu等用等用ELISA法检测了法检测了178例活动性肺结核患者和例活动性肺结核患者和151例其他疾病患例其他疾病患者血清中的者血清中的IgG A60,根据受试者工作特性曲线,根据受试者工作特性曲线(ROC)取取261.2单位为单位为截切值截切值(cutoff point),其敏感性和特异性分别为,其敏感性和特异性分别为49.4%和和79.5%,认,认为胸部为胸部X片异常的患者结合片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的

9、准确临阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。床诊断。结核菌糖脂(TBGL)抗原 结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质,具有菌属特异性。近结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质,具有菌属特异性。近年来的研究表明,糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。年来的研究表明,糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。Maekura等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法,并做了临床评价,对痰等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法,并做了临床评价,对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为56.8,对痰培养阴性的活动性肺结核,对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为的灵敏度为51.2。将。将TB

10、GL与核酸扩增方法与核酸扩增方法(NAA)联合用于检测,检出率联合用于检测,检出率比两者单独使用时进一步提高。比两者单独使用时进一步提高。Tiwari等用脂质体颗粒作为载体,利用纯化等用脂质体颗粒作为载体,利用纯化的的TBGL抗原特异的与结核病患者血清中的抗原特异的与结核病患者血清中的TBGL抗体结合,形成蓝色凝集抗体结合,形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病,其敏感性、特异性分别达颗粒来诊断活动性结核病,其敏感性、特异性分别达94%和和98.3%。该方法。该方法快速快速(4min)、经济,且可以区别活动性肺结核、卡介苗、经济,且可以区别活动性肺结核、卡介苗(BCG)免疫接种者与免疫接种者与健康

11、人群,可用于人群大规模筛选肺结核病人。健康人群,可用于人群大规模筛选肺结核病人。38kDa蛋白 38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白,只在分枝杆菌复合体中表蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白,只在分枝杆菌复合体中表达,达,BCG合成合成38kDa蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。38kDa 蛋白为一分泌蛋白,可刺激蛋白为一分泌蛋白,可刺激T细胞和细胞和B细胞免疫反应,广泛应用于结细胞免疫反应,广泛应用于结核病的血清学试验。核病的血清学试验。英国公司生产的英国公司生产的OMEGA结核抗体定量检测结核抗体定量检测Myco G、A、M试剂盒联合应用试

12、剂盒联合应用38kDa和脂多糖和脂多糖(LPS)抗原,而抗原,而TB Complex Plus试剂盒选用的是试剂盒选用的是38kDa和和16kDa抗原。抗原。Butt等对等对OMEGA试剂盒进行了评价,认为具有种特异性的试剂盒进行了评价,认为具有种特异性的TB Complex Plus和有属特异性的和有属特异性的Myco M联合应用可取得最好的效果,检测肺联合应用可取得最好的效果,检测肺结核的敏感性和特异性分别为结核的敏感性和特异性分别为87%和和93%。38kDa对活动性肺结核的诊断非对活动性肺结核的诊断非常有效,但和大肠埃希菌同源蛋白有常有效,但和大肠埃希菌同源蛋白有 30%以上的交叉,所

13、以对不同人群的以上的交叉,所以对不同人群的灵敏度波动较大,尤其对涂片阴性和合并灵敏度波动较大,尤其对涂片阴性和合并HIV感染的结核病患者效果较差。感染的结核病患者效果较差。Ag85 抗原85复合体(Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白,分子量约是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白,分子量约为为3032kDa。分枝杆菌各菌株均可分泌。分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。结核分枝杆菌。结核分枝杆菌Ag85中至少包中至少包括三种蛋白成分括三种蛋白成分Ag85A、Ag85B和和Ag85C,其中有免疫作用的主要为,其中有免疫作用的主要为Ag85A和和Ag85

14、B。Ag85具有分枝菌酸转移酶的活性,在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥具有分枝菌酸转移酶的活性,在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。它还能和人纤连蛋白必要的作用。它还能和人纤连蛋白(FN)相结合,有助于结核菌入侵宿主细胞。相结合,有助于结核菌入侵宿主细胞。Ag85可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的Ag85抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50150倍,可倍,可通过检测血循环中通过检测血循环中Ag85抗体,对活动性结核加以诊断。抗体,对活动性

15、结核加以诊断。Kashyap等用间接等用间接ELISA法检测法检测89%疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在Ag85抗体,认为检测抗体,认为检测Ag85抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。ESAT-6和CFP10 ESAT-6即即6kDa早期分泌性抗原,是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯早期分泌性抗原,是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在抗结核感染化出的一种低分子量分泌性蛋白,具有较强的细胞免疫活性,在抗结核感染的免疫回忆应答

16、中起重要作用。的免疫回忆应答中起重要作用。ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中,包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、仅存在于致病性分枝杆菌中,包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌,而型分枝杆菌,而BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。及其他非致病性分枝杆菌缺失。CFP-10即培养滤液蛋白即培养滤液蛋白10,与,与ESAT-6位于同一基因簇上,两者分布相同,位于同一基因簇上,两者分布相同,都是都是RDl区编码的。区编码的。ESAT-6和和CFP10能刺激机体产生特异性能刺激机体产生特异性IgG,利用,利用ESAT-6和和CFP10蛋白抗原能与结核分枝杆菌感染者血中特异性蛋白抗原能与结核分枝杆菌感染者血中特异性 IgG结合的特结合的特点,采用点,采用ELISA等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种BCG后所致敏,该方法明显优于后所致敏,该方法明显优于PPD作包被抗原的作包被抗原的ELISA法。法。陈全

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