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1、大口黑妒诺卡氏菌病诊断和防治技术规程1 范围本文件规定了大口黑妒(MicropterusSalmoides)养殖过程中发生的诺卡氏菌病的流行情况、发病症状、诺卡氏菌的分离培养、形态学鉴定、生理生化鉴定、16SrRNA基因鉴定、特异性鉴定及该病的防治等技术规程。本文件适用于大口黑妒诺卡氏菌病的诊断和防治。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBfr14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T6682-20
2、08分析实验室用水规格和试验方法GB/T27623.1-2011渔用抗菌药物药效试验技术规范NY5051-2001无公害食品淡水养殖用水水质标准SC/T7014-2006水生动物检疫实验室技术规范SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范SC/T1132-2016渔药使用规范DB51/T526-2005大口黑妒养殖技术规范食用鱼3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 大口黑妒诺卡氏菌病鱼源性诺卡氏菌(NOCardia)包括三个种：脚i诺卡氏菌(NoCardiaSeriolae),杀鲤诺卡氏菌(NoCardiaSalmonicida)和星状诺卡氏菌(NOCardielaSi
3、eroidec,感染大口黑妒的主要为SW诺卡氏菌种，本文件中所提及的大口黑妒诺卡氏菌病均为鲫i诺卡氏菌感染引起大口黑妒发病或死亡的细菌性疾病。4 试剂和材料用水符合GB/T6682-2008中“4.1”一级水规格。4 .2试剂与培养基革兰氏染液配制按照GB/T14926.43-2001中“3.1”的规定执行，牛脑心浸液培养基（BHI）,50TAE缓冲液，1%X脂糖凝胶，七叶昔培养基、明胶培养基、TE缓冲液等相关配方见附录A,细菌基因组DNA提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂。4.3 16SrRNA扩增引物16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P-F：5-AGAGTTTGATCCTGGC
4、TCAG-Sr,P-R：5,-Ggttaccttgttacgactt-yo4.4 特异性鉴定引物特异性鉴定上游引物N5F1：5TGAGCCTGAACTGCATGGTTC_3:下游引物N5R1：5,-ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3,o5 设备和仪器超净工作台、光学显微镜、PCR仪、电泳仪、离心机、生化培养箱、恒温摇床培养箱、常规细菌接种器械（包括培养皿、酒精灯、接种环、酒精棉等）、-4C2（C冰箱等。6 临床检查6.3 流行情况发病水温：水温1532C时都可流行，我省在每年4月底开始大规模爆发，直至10月均有该病流行，25-28C为发病高峰期，死亡率高，进入冬季大口黑鲸停食后死亡
5、率下降。6 .2临床和解剖症状患病鱼反应迟钝、离群独游，食欲下降，主要病变为体表出现溃疡灶以及出血点，在鲍丝基部、躯干皮下脂肪、肌肉、腹腔（包括肝、肾、脾、鱼鳏、肠系膜）出现乳白色或黄色结节，结节大小通常直径0.5-3mm,肝脏肿大、淤血，鱼鳏腔内有积液等。7 实验室样品采集样品采集按SC/T7013-2008中“4,5,6,7,8”规定执行。8 细菌的分离与培养用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取肝脏、肾脏和脾脏进行病原菌分离。利用接种环，划线接种至BHl固体培养基，28培养箱恒温培养7d,从形态一致的优势菌群中挑取单个菌落进一步纯化培养。9 细菌的鉴定9.1 形态学鉴定9.
6、1.1 菌落形态分离病原菌在BHl固体培养基28C培养7d后观察菌落形态。9.1.3 细菌形态革兰氏染法染色观察，参照GB/T14926.43-2001中“3.1.5”规定执行。9.1.4 2生化特性鉴定9.2.1 氧化酶试验按SC/T7014-2006中“表2”规定执行，菌落呈玫瑰红色，然后变为深紫色者均为阳性。9.2.2 尿素酶试验按SCT70142006中“表2”规定执行，红色为阳性。9.2.3 硝酸盐还原试验按SC/T7014-2006中“表2”规定执行，红色为阳性。9.2.4 过氧化氢酶试验挑取单个菌落，置于洁净的载玻片上，加入3%过氧化氢12滴，观察有无气泡产生，有气泡产生者为阳性
7、。9.2.5 柠檬酸盐试验按SaT70142006中“表2”规定执行，培养基蓝色为阳性。9.2.6 七叶背水解试验将待检菌接种于七叶昔培养基，28培养7d,培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。9.2.7 明胶液化试验将待检菌种接种于明胶培养基，28C培养7d,明胶液化者为阳性。9.2.8 淀粉水解试验按SC/T7014-2006中“表2”规定执行，呈蓝色者为阴性，无蓝色者为阳性。9.316SrRNA鉴定9.3.1 总DNA提取DNA提取采用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作。9.3.2 16SrRNA基因序列扩增将上述提取DNA作为模板，利用“4.3”中的引物扩增16SrRNA
8、序列，反应在25L体系中进行：PCRPremix12.5L,上下游引物各L0L,2.0L模板DNA,双蒸水补足至25L0反应条件：95预变性5min；95C变性30s,55退火30s,72延伸L5min,循环扩增30次；72C终延伸Iomin04保存备用。空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。9.3.3 X脂糖凝胶电泳用IXTAE电泳缓冲液配制1%的X脂糖凝胶（含0.5LmLEB）平板，凝固后放入水平电泳槽，使泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述扩增产物6L样品加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约1530min,当指示剂到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带，在长波紫外灯下用
9、刀片切下含有目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。9.3.4 PCR扩增产物纯化按每0.1gX脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入上述含有目的条带胶块的离心管中。经漩涡震荡仪震荡Imin_2min,将离心管在放置1h,使凝胶完全冻结。9.3.4.3 37水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡Imin-2min；14000r/min离心5min。9.3.4.4 取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,混匀，12000r/min离心5min。9.3.4.5 取上清液加入等体积的氯仿：异戊静（24:1）,混匀，12000r/min离心5min。
10、9.3.4.6 向收集的水溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醉，置-20C过夜或70C放置1h-2ho9.3.4.7 14000r/min离心IOmin,弃上清。9.348 将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置-2（C保存，待测。9.349 测序与同源性分析将上述提取的DNA进行测序，并于参考序列（附录B）进行比对分析。9.4特异性检测1.1 .1特异性基因扩增将“9.3.1中提取DNA作为模板，并以维氏气单胞菌基因组DNA作为对照，利用“4.4”中的引物扩增，进行特异性PCR检测。反应在25L体系中进行，反应条件：94预变性41山：94变性Imin,58退
11、火30s,72延伸1.501山，循环扩增30次；72终延伸IOmin.1.2 .2序列检测PCR产物于1%的X脂糖凝胶电泳进行检测，观察片段大小。10结果判定10.1 菌落形态沙粒状淡黄色菌落，粗糙易碎，边缘不整齐，在表面形成褶皱。10.2 细菌形态革兰氏染色呈阳性，镜检可见菌体紫色分枝状。10.3 生理生化特性生理生化反应试验结果见表1O表1鲫诺卡氏菌生理生化特性检测项目参照结果检测项目参照结果七叶背水解+过氧化氢酶+明胶溶解-氧化酶-淀粉水解-服酶-硝酸盐还原-柠檬酸盐+注：“十”表示阳性，表示阴性10.4 16SrRNA基因序列检测测定的16SrRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，
12、同源性达98%以上。10.5 特异性检测预计扩增片段为1069bp。PCR产物于1%的X脂糖凝胶电泳进行检测，在IooObP条带处得到预期大小的单一明亮条带，而作为对照的维氏气单胞菌无条带产生，判定为阳性。11综合判定符合以下a）b）c）三条特征的基础上，d）或者e）特征出现任意一条者判定为大口黑妒诺卡氏菌病。a）患病大口黑妒流行情况和发病症状与“6.1”和“6.2”相符；b）所分离病原菌菌落与菌体形态分别与“10.1”和“10.2”相符；c）生理生化反应结果与“表1”相符；d）16SrRNA基因序列与附录B所列的基因序列同源性分析结果达98%以上。e）分离菌株DNA特异性基因检测阳性12防治
13、方法12.1水质使用无诺卡氏菌污染的水源和水系统，养殖用水符合NY5051-2001中“3.2”的规定。12.2 清塘消毒清除池塘过多的淤泥，并经冬季阳光曝晒，放养前一个月，每667?面积用生石灰75kg100kg,化浆后全池泼洒，以改善池塘底质和杀灭病菌。12.3 鱼苗购入从国家级、省级良种场或经国家批准的种苗生产场购买经检疫合格的大口黑妒鱼苗。12.4 饲料使用大口黑妒专用配合饲料，避免经常投喂冰鲜野杂鱼。12.5 日常管理做好投饲及日常管理工作，参照DB51/T526-2005中“4”的规定执行。12.6 养殖水体消毒在该病高发期，可选用复合碘溶液，戊二醛溶液或苯扎澳镂等渔用消毒杀菌药物
14、全池泼洒进行预防及治疗，按照商品说明使用。12.7 微生态制剂调节在疾病高发期，可选用芽泡杆菌、乳酸杆菌和光合细菌全池泼洒，竞争性抑制诺卡氏菌的大量繁殖,按照商品说明使用，但不能与力2.6”中的消毒药物同时使用，至少间隔三天。12.8 敏感抗生素药物筛选若该病已经发生，参照GBT27623l2011中“5”的规定筛选敏感抗生素药物，选用敏感抗生素药物进行拌料投喂，药物使用应符合SC/T11322016中“6”的要求。附录A（规范性附录）培养基和试剂配制方法A.1BHI牛脑心浸液固体培养基在80Oml双蒸水中加入37gBHI牛脑心浸液，15-2OgX脂粉，混匀，加热搅拌溶解，调节PH值为7.40
15、.2,定容至100omL12IeC高压灭菌15min。A.250XTAE缓冲液在40OmL双蒸水中溶解12IgTriS碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5molLEDTAo再加双蒸水定容至500mL,室温保存。使用时，配成IXTAE电泳缓冲液A.31%X脂糖凝胶X脂糖Ig中加入IXTAE缓冲液100mL,加热溶解后，加入5LGoldenview混匀。A.4七叶甘培养基胰蛋白陈5.0g,磷酸二氢钾LOg,七叶昔3.0g,柠檬酸铁钱0.5g,混匀，加热搅拌溶解，调节PH值为7.40.2,定容至IOoOm1,C高压灭菌15minA.5明胶培养基NaCI5g,蛋白陈10g,牛肉膏3g,明胶120g,混匀，加热搅拌溶解，调节PH值为740.2,定容至100Oml,121C高压灭菌15min0A.6TE缓冲液80Oml双蒸水中溶解TriS碱1.21g,乙二胺四乙酸二钠0.372g,调节PH为8.0,再加双蒸水定容至IooOmL,室温保存。A.7
