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1、葡萄糖-6-磷酸(Glucose6-phosphate,6PG)含测定试剂盒说明书微法100管/48样注意I正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义:6PG(Glucose-6-phosphate,葡萄糖磷酸,又称6.磷酸葡萄糖),是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物,广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中,葡萄糖被已糖激醉催化生成葡萄糖磷酸,然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸,以继续糖酵解的其它步骤;而在戊糖磷酸途径中,葡萄糖-6.磷酸是其第一个底物,该过程也是生成NADPH的主要途径。此外,葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。渊定原
2、理:6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在I-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色,在450nm下测定吸光值。需自备的仪器和用品:酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸储水。试剂的组成和配制:提取液:液体60mLxl瓶,4保存;试剂一:液体12mLl瓶,4*C保存:试剂二:粉剂Xl瓶,20保存;试剂三:液体L5mLxl管,4C避光保存。6PG提取:1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(IO4个):提取液体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入ImL提取液),
3、超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),8000g,25C离心Iomin,取上清待测。2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:570的比例(建议称取约0.1g组织,加入ImL提取液),进行冰浴匀浆,8000g,25离心IOmin,取上清待测。3、血清(浆)等液体样品:直接测定。渊定步Ilh1、解标仪预热30min以上,调节波长至450nm02、试剂二的配制:临用前加入3mL水充分溶解待用,用不完的试剂分装后20保存;3、工作液的配制:临用前按照样本数量,按以下比例配制工作液试剂名称(L)测定工作液对照工作液试剂一100I(X)试剂二50水50试
4、剂三10IO4、样本测定按下表在96孔板中加入如下试剂试剂名称(L)测定管对照管样本5050测定工作液150对照工作液15037C避光孵育30min,450nm下测定吸光值A测定与A对照,ZSA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。6PG含计算:1、标准条件下测定回归方程为y=38589x-00016,R2=0.997;X为6PG含量(molmL),y为吸光值。2、按照血清(浆)体积计算6PG含量(nmol/mL)=(A+().(X)16)3.8589VIV11(XX)=259.1(A+0.0016)3、按照蛋白浓度计算6PG含量(nmol/mgprot)=(A+0.(X)16)3.8589V1(V1Cpr)IO(X)=259.1(A+0.(X)16)Cpr4、按照样品质量计算6PG含量(nmolg鲜重)=(A+0.0016)3.8589V1(WV1V2)I(XX)=259.1(A+0.(X)16)W3、按照细菌或细胞密度计算6PG含量(nmol104ceil)=(A+0.0016)3.8589Vl(500VlV2)IO(X)=0.518(A+0.16)VI:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,1mL:Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g:50():细菌或细胞总数,500万;】OO0,Umol到nmol的换算系数。