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1、酶类药物酶类药物n一一.酶类药物的概述酶类药物的概述n二二.酶类药物的提取和纯化酶类药物的提取和纯化n三三.重要酶类药物的制备重要酶类药物的制备n 酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。n 绝大多数酶的本质是蛋白质或蛋白质与辅酶的复合体。n 由于酶专一性强及催化效率高，使其在疾病的治疗等方面具有针对性强，疗效高等特点。一、药用酶类的概述n（一）酶的特性n 酶是由活细胞产生的具有特殊催化n 功能的一类蛋白质。其特点：n 催化效率高n 专一性强n 反应条件温和n 催化活性受到调节和控制l 目前，从生物界已发现2000多种酶。l 其中：工业用酶约5060余种；治疗和诊断用酶1
2、20多种；试剂酶300多种；基因工程工具酶100多种。一、药用酶的分类及应用一、药用酶的分类及应用（一）促进消化酶类（一）促进消化酶类（二）消炎酶类（二）消炎酶类（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类（四）抗肿瘤的酶类（四）抗肿瘤的酶类（五）与生物氧化还原电子传递有关的酶（五）与生物氧化还原电子传递有关的酶（六）其他药用酶（六）其他药用酶1、促进消化酶类n 这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂类等。白质、糖类和脂类等。n 最早使用的医用酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉最早使用的医用酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀
3、粉酶、纤维素酶等水解酶。酶、纤维素酶等水解酶。n 目前已从微生物制的不仅能在胃中、同时也能在目前已从微生物制的不仅能在胃中、同时也能在肠中促进消化的复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉肠中促进消化的复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等。酶、脂肪酶和纤维素酶等。2、消炎酶类n 蛋白酶的消炎作用已为实验所证实，从而促进了蛋白酶的消炎作用已为实验所证实，从而促进了蛋白酶作为消炎剂的开发。如临床上采用胰蛋白蛋白酶作为消炎剂的开发。如临床上采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝半袋没等治疗炎症和浮酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝半袋没等治疗炎症和浮肿疾患，清除坏死组织等。肿疾患，清除坏死组织等。n 消炎酶一般做成
4、肠溶性片剂。消炎酶一般做成肠溶性片剂。3、溶血纤维蛋白酶类n 这类酶的作用是防止血小板凝集、阻止血纤维蛋这类酶的作用是防止血小板凝集、阻止血纤维蛋白形成或促进其溶解。白形成或促进其溶解。n 已应用于临床的主要有链激酶、尿激酶、纤溶酶、已应用于临床的主要有链激酶、尿激酶、纤溶酶、凝血酶等。凝血酶等。4、抗肿瘤酶n 能治疗某些肿瘤，如能治疗某些肿瘤，如L-天冬酰胺酶可用于治疗白天冬酰胺酶可用于治疗白血病。血病。n 谷氨酰胺酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨谷氨酰胺酶、精氨酸酶、丝氨酸脱水酶、苯丙氨酸氨解酶和亮氨酸脱氢酶等也具有抗肿瘤活性。酸氨解酶和亮氨酸脱氢酶等也具有抗肿瘤活性。5、其他药用酶n
5、如青霉素酶能分解青霉素，可应用于治疗青霉素如青霉素酶能分解青霉素，可应用于治疗青霉素引起的过敏反应引起的过敏反应n 超氧化物歧化酶可消除超养负离子、防止脂质过超氧化物歧化酶可消除超养负离子、防止脂质过氧化，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面有显著疗氧化，在抗衰老、抗辐射、消炎等方面有显著疗效效n 葡聚糖酶和右旋糖酐酶能预防龋齿等葡聚糖酶和右旋糖酐酶能预防龋齿等一.酶类药物的原料来源n(一)原料选择n 选料应注意一下几点选料应注意一下几点:n (1)不同酶的原料选择不同酶的原料选择n (2)注意不同生长发育情况及营养状况注意不同生长发育情况及营养状况n (3)从原料来源是否丰富考虑从原料来源是否丰富考
6、虑n (4)从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手n (5)如用动物组织做材料如用动物组织做材料,则此动物宰杀后应则此动物宰杀后应 立立即取材即取材 一.酶类药物的原料来源n(二)微生物酶制剂高产菌株的选育n 优良菌种的获得有三条途径优良菌种的获得有三条途径:n 1.从自然界分离筛选从自然界分离筛选;n 2.用物理或化学方法处理用物理或化学方法处理,诱变诱变;n 3.用基因重组与细胞融合技术用基因重组与细胞融合技术;一.酶类药物的原料来源n(三)微生物酶制剂生产的发酵技术n 首先要合理选择培养方法首先要合理选择培养方法,培养基培养基,培养温培养温度度,PH和通气量等和通气量等,在工业生产中还要摸
7、索一系列在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件工程和工艺条件,如培养基的灭菌方式如培养基的灭菌方式,种子培养条种子培养条件等件等.还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺,这些这些条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益条件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益.返回目录返回目录二.酶类药物的提取和纯化n(一)生物材料的预处理n 1.动物材料的预处理n (1)机械处理机械处理n 用绞肉机将事先切成的组织绞碎用绞肉机将事先切成的组织绞碎.n (2)反复冻融反复冻融n 冻到冻到-10度左右度左右,在缓慢溶解至室温在缓慢溶解至室温,如此反如此反n 复多次复多次.n (3)
8、丙酮粉丙酮粉n 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉,可在低可在低温下保存温下保存n 几年几年.二.酶类药物的提取和纯化n 2.微生物的预处理n 要是酶是胞外酶要是酶是胞外酶,则可除去菌体后再直接从发酵则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附取酶液中吸附取酶.但对胞内酶则需破壁但对胞内酶则需破壁,制成无细胞的制成无细胞的悬液后再行提取悬液后再行提取.通常用离心或压滤的方法取得菌通常用离心或压滤的方法取得菌体体,用生理盐水洗涤后除去培养基后用生理盐水洗涤后除去培养基后,应深冻保存应深冻保存,有时为了大量保存或有利于提取有时为了大量保存或有利于提取,可采用干燥法可采用干燥法.
9、因因为干燥法能导致细胞自溶为干燥法能导致细胞自溶,增加酶的释放增加酶的释放,从而在后从而在后处理中破壁不必太剧烈就能到达预期目的处理中破壁不必太剧烈就能到达预期目的.二.酶类药物的提取和纯化n(1)干燥法干燥法n 空气干燥空气干燥 特别适合于酵母特别适合于酵母,当其中由于喷雾当其中由于喷雾干燥法的温度较高干燥法的温度较高,对热稳定性差的酶不适用对热稳定性差的酶不适用.n 真空干燥真空干燥 此法对细菌特别适用此法对细菌特别适用.对敏感性的对敏感性的酶酶,应加入少量还原剂保护酶应加入少量还原剂保护酶.n 冷冻干燥冷冻干燥 对较敏感的酶宜用此法对较敏感的酶宜用此法.二.酶类药物的提取和纯化n(2)机
10、械法n 常用的方法有研磨法常用的方法有研磨法,组织匀浆法组织匀浆法,超声波法超声波法,高高速匀浆法等速匀浆法等.n(3)酶法处理n 用的最多的是溶菌酶用的最多的是溶菌酶,也可用脱氧核糖核酸酶处也可用脱氧核糖核酸酶处理理二.酶类药物的提取和纯化n(二)酶的提取n 提取方法主要有水溶液法提取方法主要有水溶液法,有机溶剂法和表面活有机溶剂法和表面活性剂法性剂法n 1.水溶液法n 常用稀盐溶液或缓冲液提取常用稀盐溶液或缓冲液提取.为了防止提取过程为了防止提取过程中酶活力降低中酶活力降低,一般在低温下操作一般在低温下操作,但对耐高温的酶但对耐高温的酶,应提高温度应提高温度,是杂蛋白变性是杂蛋白变性,以利
11、于酶的提取纯化以利于酶的提取纯化.二.酶类药物的提取和纯化n PH的选择对提取也很重要的选择对提取也很重要,应考虑应考虑:n 1.酶的稳定性酶的稳定性;n 2.酶的溶解度酶的溶解度;n 3.酶与其他物质结合的性质酶与其他物质结合的性质.n 选选PH的总原则是的总原则是:在酶稳定的在酶稳定的ph范围内范围内,选择偏高等选择偏高等电点的适当电点的适当ph.n 一般来说一般来说,碱性蛋白酶用酸性溶液提取碱性蛋白酶用酸性溶液提取,酸性蛋白酶用酸性蛋白酶用碱性溶液提取碱性溶液提取;提取时加少量盐可提高酶的溶解度提取时加少量盐可提高酶的溶解度.二.酶类药物的提取和纯化n 2.有机溶剂法n 某些结合酶如微粒
12、体和线粒体膜的酶某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶,由于和脂由于和脂质牢固结合质牢固结合,用水溶液很难提取用水溶液很难提取,为此必须除去结合为此必须除去结合的脂质的脂质,且不能使酶变性且不能使酶变性,最常用的有机溶剂是丁醇最常用的有机溶剂是丁醇.丁醇具有亲脂性和亲水性丁醇具有亲脂性和亲水性,在脂与水分子间起类似在脂与水分子间起类似去垢剂的桥梁作用去垢剂的桥梁作用.二.酶类药物的提取和纯化n3.表面活性剂n 表面活性剂有亲水性或疏水性的原子基表面活性剂有亲水性或疏水性的原子基团团.有阳离子型有阳离子型,阴离子型和非离子型的阴离子型和非离子型的.表面表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中活性剂能与蛋
13、白质结合而分散在溶液中,故故可用于提取结合酶可用于提取结合酶,但此法用得较少但此法用得较少.二.酶类药物的提取和纯化n 4.酶分离和纯化工作中的注意事项n(1)防止酶蛋白变性n(2)防止辅因子的流失n(3)防止酶被蛋白水解酶降解返回目录返回目录三.重要酶类药物的制备n(一一)药用酶类的概述药用酶类的概述n(二二)重要酶类药物重要酶类药物 1.胃蛋白酶胃蛋白酶 2.胰蛋白酶胰蛋白酶 3.尿激酶尿激酶 4.溶菌酶溶菌酶 5.L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶 6.超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）7.细胞色素细胞色素C 8.弹性蛋白酶弹性蛋白酶 9.激肽释放酶激肽释放酶 1.胃蛋白酶n 广泛存在于
14、哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃液粘膜中提取。pI1.0，最适pH1.52.0，最适温度37-40。n 药用胃蛋白酶药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的是胃液中多种蛋白水解酶的混合物混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。外观为淡黄色粉末，有肉类特殊气味及微酶制剂。外观为淡黄色粉末，有肉类特殊气味及微酸味。酸味。1.胃蛋白酶n 胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，尤其对两个相邻芳香族氨基酸（苯丙、酪、色）构成的肽键最为敏感。对蛋白质水解不彻底，产物有胨、肽和氨基酸的混合物。n 临床上主要用于因食蛋白性食物过
15、多所致消化不良及临床上主要用于因食蛋白性食物过多所致消化不良及病后恢复期消化机能减退等。与碱性药物配伍会降低病后恢复期消化机能减退等。与碱性药物配伍会降低效果。效果。1.胃蛋白酶生产工艺n 工艺路线工艺路线1.胃蛋白酶结晶胃蛋白酶的制备n 药用胃蛋白酶原粉，20%酒精溶解。调pH3.0。5静置20h后过滤，硫酸镁盐析。盐析物在乙醇中溶解,过滤，滤液用硫酸调pH至1.82.0，即析出针状蛋白酶。n 制剂：含糖胃蛋白酶。系胃蛋白酶用乳糖、葡萄糖或蔗糖稀释制得。2.胰蛋白酶n 从牛、羊、猪胰脏提取、结晶的冻干制剂，易溶于水，pI10.1。在酸溶液中稳定，在碱溶液中加热则变性沉淀。Ca2+有保护和激活
16、作用。n 牛胰蛋白酶原有牛胰蛋白酶原有229229个氨基酸组成，含个氨基酸组成，含6 6对二硫键，在肠对二硫键，在肠激酶或自身催化下，释放出激酶或自身催化下，释放出6 6肽，变成有肽，变成有活性活性的胰蛋白酶。的胰蛋白酶。2.胰蛋白酶胰蛋白酶原激活示意图2.胰蛋白酶n 牛胰蛋白酶分子量24000，由223个氨基酸残基组成。n 胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。胰蛋白酶属丝氨酸蛋白水解酶。酶本身很容易自溶，降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力逐渐下降或丧失。n 胰蛋白酶临床用于抗菌消炎，还用于治疗毒蛇咬伤。胰蛋白酶临床用于抗菌消炎，还用于治疗毒蛇咬伤。也是一个重要的工具酶。也是一个重要的工具酶。2.胰蛋白酶生产工艺3.尿激酶n 是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。n 有多种分子量形式，主要有31300、54700两种（低分子尿激酶（L-UK）、高分子尿激酶（H-UK）。高分子尿激酶尿胃蛋白酶尿胃蛋白酶原低分子尿激酶 H-UKH-UK溶解血栓能力高于溶解血栓能力高于L-UKL-UK。尿激酶的。尿激酶的pIpI为为pH8-9,pH8-9,主主要
