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1、医院检验科钙的比色法测定1.实验原理Vitros钙试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。将一滴10Ul的患者样品滴于干片上，分布层会使之均匀地分布。于是钙离子从附着的蛋白质上游离出来，透过分布层进入下面的试剂层，与神III染色剂生成有色复合物，使最大吸收峰发生改变。经过一段孵育期,有色复合物的反射强度可通过光谱法测定。所产生有色复合物的总量与样品中的钙含量是成正比的。测定方式：比色法波长：6S0nm测试时间和温度：37C下约5分钟。反应过程：PH5.6Ca+2+神III有色复合物2.标本采集2.1病人准备：无特殊要求。2.2样品类型：血清、肝素锂或钠抗凝血浆、定时
2、或随时采集未加防腐剂的酸化尿液。2.3标本采集与处理：所有用于钙测试的样品，特别要注意一个问题：佩戴用碳酸钙粉制造的防护手套会在样品处理过程中造成污染（例如，吸管滴头，吸管，样品杯和杯盖），而这些被污染的消耗品在加样时又会污染待测样品，从而使测试结果偏高。因此建议在拿这些消耗品时使用不含碳酸钙粉的手套，或者直接用干净的空手去拿，也可以用流水轻轻地冲洗有粉末的手套（不要用肥皂或任何类型的去污剂）然后再将其干燥后使用。说明：标有不含粉末的手套，在手套的里层也可能含有一些污染性粉剂。2.3.1血清和血浆样品卧床患者的结果会偏低3%；淤血的钙浓度会偏高15%样品采集后2天内要离心标本，吸出血清。处理样
3、品时要将其当成生物污染品。2.3.2尿液样品定时或随时采集未加防腐剂的酸化尿液。依照以下程序对测试钙的尿样进行酸化处理。注意：这一程序只用于患者的样品，质控标本不需如此处理。您可以将24h尿液全部或其中一部分进行酸化。当尿液还有其它不需酸化的测试项目时，可以将部分尿液进行酸化。酸化全部尿液：收集尿液前将20mL6N的盐酸倒入收集尿液的容器内（随机收集的尿液中加ImL6N的盐酸）。如果收集前没有加盐酸，按照以上步骤酸化后，要将其放置至少Ih以后才能测试。酸化部分尿液：将全部尿液充分混匀后，吸出5mL。在5mL尿液中加100UL6N的盐酸，然后充分混匀。确定样品的PH值在1.55.0之间，必要时进
4、行调节。测试样品。注意：酸化后尿样的PH值要在1.5、5.0之间，PH值低于1.5会产生一个负偏差。处理样品时要将其当成生物污染品。3.标本的存放：血清、血浆：如果测试时间拖延超过4小时，应将样品冷藏在2-8,-18C下冷藏可长期保存。尿标本室温下最多5天，冷藏最多5周，-18以下冷冻可保存6个月。4.标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。5.标本拒收的标准：采样管含EDT,氟化物，草酸或枸椽酸的样品，因为这些物质会与钙螯合而使结果产生负偏差。此外，接受EDTA治疗的患者血样也不能测试。6.试验材料：6.1测试Ca所需的物品包括：VitroS化学定标物Kit1；VitroS特制质控
5、液；VitrOS尿液酸化剂6N的盐酸。强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储臧温度。6.1.1试剂组成：干片成分：反应成份是碑III染色剂。其它成份有染色物质，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，交叉连接剂和媒染剂。干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。6.1.2试剂准备：从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态1828C。因此从冰箱中取出的试剂盒至少要在室温下要放置60分钟，而冷藏的试剂盒至少要在室温下放置30分钟。去除内包装后立即将干片盒放入仪器的储藏器中。说明：在试剂
6、盒达到室温后的24小时之内必须将其装入仪器中。6.1.3试剂稳定性与贮存未开封的干片盒：存储在2-8C或低于该范围。在机内干片储藏器中的干片盒：在仪器上放置时间不能超过4周，否则要更换新试剂。当仪器关闭时间不超过2个小时时，可将干片盒留在储藏器中。出现以下情形要做质控检测：仪器关闭时间超过2小时；再次装载从仪器储藏器中取出的干片盒。如果储藏正确，VitrosCa干片可保质到包装盒上标明的有效期限。参见VITROS250干化学分析仪试剂稳定性及贮存.SOP文件。6.1.4变质指示：超过有效期的试剂干片不能使用。6.1.5注意事项：为避免干片盒打开以前其内包装受损，不能摔打干片盒；不要让尖利物刺入
7、内包装。6.2校准品：用VitroS化学定标物KitIO血清、血浆用相同的定标液，不过各自的SAVS值不同。有关标准液的配制，使用及保存的配制，保存和稳定的详情，可参阅VITR0S250干化学分析仪校准品和质控品.SOP文件。6.3质控品：使用VitroS特制的质控物品；若使用其它的一些质控物品，当与别的Na测试方法比较时就会出现差异。如：用人血清/血浆混合物分离制成的质控物品，含有高浓度防腐剂，稳定剂和其它化学添加剂的质控物品；含有或高或低总蛋白浓度的质控物品；乙烯乙二醇作稳定剂的质控物品不能使用。尿钙有专门的质控，由于不含未分解的钙而不需进行特别酸化处理。有关质控液的配制，保存和稳定的详情
8、，可参阅VITROS250干化学分析仪校准品和质控品.SOP文件。7.仪器：美国强生厂家VITRoS250全自动干式生化分析仪。具体测试程序请参阅操作手册的介绍。8.操作步骤：将试剂复温后直接放入仪器，样品编程，仪器5分后自动打印结果。具体测试程序请参阅VITROS250操作手册.SOP。具体定标程序：用Vitros化学定标物Kit1,定标液复溶后必须在1小时以内使用，以免PH值发生变化。参阅操作手册的相关章节内容。何时进行定标：在维护和保养时更换了仪器的重要部件。质控结果持续超出线性范围内时，详情参阅操作手册。管理条例上指定的时间，在美国，CLlA要求至少每6个月定标一次。说明：进行尿钙定标
9、时，仪器会自动进行尿钾的定标。9.检验结果的判断与分析10.质量控制：操作建议：将质控物质当成生物污染品来处理；将质控液与患者样品同时进行测试；每天至少做一次质控以检测仪器运行状况；选择质控浓度来检查与临床的相关性；其它详情参阅操作手册质控章节的有关内容。有关质控操作的常规性条例可参照国际质控检测(IQCT)的内容。在每一批标本中都应把质控血清做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。11.计算方法：以用VitrOS化学定标物校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果，以mmol/L报告
10、。12.参考值范围血清/血浆2.10-2.55mmolL尿液：无钙饮食0.13-LOmmOI/天低于平均量钙饮食1.25-3.75mmol/天平均量钙饮食2.50-7.5Omlllol/天参考值因性别、年龄、饮食和地域的不同而有所差别。根据好的实验室经验，每个实验室应建立自己的参考值。13.临床意义钙是骨骼中的主要矿物质成分，人体中99%的钙都存在于骨骼中。钙离子在传送神经冲动，维持正常的肌肉收缩方面起着非常重要的作用。人体中非正常的血钙浓度预示可能患有甲状腺功能失调，骨骼疾病，癌症，营养不良和吸收不良综合症，维生素D缺乏，过量摄入含钙的抗坏血酸以及肾脏疾病。14.操作性能14.1线性范围：血
11、清/血浆：0.25-3.49mmol/L;尿液：0.25-4.44mmolL14.2精密度：在VitrOS250生化仪上用质控液来测精密度。结果反映了该方法的精密度。当仪器维护，周围环境，干片处理和保存，质控液的复溶以及样品处理等方面发生变化都会影响结果的重复性。日间精密度血清X(mmolL)S(mmo1/L)CV(%)室间精密度=20天X(mmolL)S(mmolL).CV(%)样品1n=782.30.02样品12.30.041.5样品2n=783.00.02样品23.00.041.3日间精密度尿液X(mmo1/L)S(mmo1/L)CV(%)室间精密度n=22天X(mmo1/L)S(mmo
12、lL)一CV(%)样品1n-88L40.02样品11.40.064.0样品2n=882.00.02样品22.00.084.3样品3n=842.80.03样品32.80.083.0样品4n=883.00.02样品43.00.082.6*日间福半密度是将2至3份相同的样品在一天中运行两次，然后对测试结果进行统计计算。*室间精密度是用同一个批号的干片每周定标一次，然后对测试结果进行统计计算。14.3方法学比较：用Vitros700仪器和原子吸收分析法分别测试相同的血清/尿液样品，对比结果显示VitrOS方法的准确度良好；用VitrOS250仪器与VitrOS700仪器测试相同的血清/尿液样品，对比结
13、果显示Vitros250方法的准确度良好，血清：Y=0.99X+0.2(r=0.999,N=72,检测范围0.85-3.49mmolL);尿液：Y=Lo2X-0.03(r=0.998,N=84,检测范围0.25-4.17mmolL)o14.4灵敏度：血清/血浆和尿液：0.25mmol/L14.5特异性：经测试，以下物质对VitroSCa干片法均无干扰（偏差0.2mmol/L）,阿司匹林30mg/Dh对氨基水杨酸23mg/dL、胆红素20mg/dL、氯IJ塞嗪（利尿降压药）3mg/dL、环泡菌素20ugmL,葡聚糖1000mg/dL、乙醇300mgdL、龙胆酸0.5mgdL、血红蛋白150mg/
14、dL、镁4.32mgdL钠156mg/dL、甘油三酯800mg/dL、尿素氮100mg/dL。14.6病人结果可报告范围：血清/血浆：0.25-3.49mmol/L:尿液：0.25-4.44mmolLo15.超出范围结果处理：如样品中的钙浓度血清/血浆：3.49mmol/L；尿液：4.44mmol/L超出该范围，请按下列步骤进行稀释：血清或血浆：用等量试剂级别的水或生理盐水稀释样品，重新测试，将测试结果乘以2,就得到原始样品中钙的浓度。尿液：用等量试剂级别的水稀释样品，重新测试，将测试结果乘以2,就得到原始样品中钙浓度。16.病危报警值的处理当血清钙测定值）3.5nol/L或1.6mol/L时
15、，在经过复查等确认手段处理后应及时向临床主管医生汇报。17.方法局限性17.1本法线性上限血清/血浆3.49mmolL,尿液均为4.44mmol/L:如果样品中的钙浓度超出系统的测试线性范围，请按下列步骤进行稀释:血清或血浆：用等量试剂级别的水或生理盐水稀释样品，重新测试，将测试结果乘以2,就得到原始样品中钙的浓度。尿液：用等量试剂级别的水稀释样品，重新测试，将测试结果乘以2,就得到原始样品中钙的浓度。17.2干扰物质：血清：服用泛影钠患者的血样不能用此法测钙，舒拉明（抗寄生虫药物）浓度达300ug/mL时，会使钙结果产生T0%的偏差。尿液：冰醋酸IOmL/L分析物浓度钙浓度为3.5mmol/L时，产生-0.3mmol/L的干扰；浓缩氢氯酸IomL/L分析物浓度钙浓度为2.9mmol/L时，产生-0.45mmol/L的干扰；枸椽酸IOmL/L分析物浓度钙浓度为1.8mmol/L时，产生-0.2mmol/L的干扰；麝香草酚IOmL/L分析物浓度钙浓度为2.5mmol/L时，产生-0.ImmoI/L的干扰。不加盖的
