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1、1.2基因工程的基本操作程序（共2课时）【学习目标】1、简述基因工程原理及基本操作程序。2、尝试设计某一转基因生物的研制过程。【学习重点】基因工程基本操作程序的四个步骤。【学习难点】（1）从基因文库中获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因。自主研习（理知识，固基础）一、目的基因的获取：1、目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的O2.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多，导人受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库：含有一种生物的基因种类VICDNA文库：含有一种生物的基因目的基因的获取根据基因的有关
2、信息：基因的序列、基因在上的位置、基因的产物mRNA、基因的产物蛋白质等特性获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因。PCR：是一项在生物体外特定DNA片段的核酸合成技术。 条件：己知目的基因的序列。 过程：目的基因DNA受热形成,与结合，然后在的作用下进行延伸形成DNA。方式：指数扩增=2“（n为扩增循环的次数）（3）人工合成法：基因较小，核甘酸序列己知，可以人工合成。二、基因表达载体的构建1、表达载体的组成：目的基因+标记基因等。2、启动子：位于基因的,它是结合的部位，驱动基因转录产生InRNA。3、终止子：位于基因的,终止o4、表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且给
3、下一代；使目的基因和发挥作用。5、标记基因：受体细胞是否含有目的基因。6、不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和的过程。（二）方法1、将目的基因导入植物细胞（I）农杆菌转化法农杆菌特点：易感染植物和裸子植物，对_植物没有感染力；Ti质粒的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。转化：目的基因插人农杆菌f导入植物细胞f目的基因整合到植物细胞染色体上一目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。（2）基因枪法基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
4、（3）花粉管通道法花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）2 .将目的基因导入动物细胞（1）方法：注射技术。（2）操作程序：目的基因表达载体一取卵（受精卵）一显微注射一注射了目的基因的受精卵移植到性动物的内发育一新性状动物。3 .将目的基因导人微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。（2）转化：处理细胞-细胞-表达载体与感受态细胞混合一一细胞吸收DNA分子。四、目的基因的检测与鉴定1 .检测（1）方法：标记了的、抗原抗体杂交。（2）内容 检测转基因生物染色体的DNA是否插入o 检测目的基因是否
5、转录O 检测目的基因是否翻译成O2 .鉴定：鉴定、抗病鉴定等。互动探究（释疑惑，升能力）基因工程图解:抗虫棉的培育过程探究一目的基因的获取问题1:什么是目的基因？问题2:获取目的基因的途径有哪些？获取目的基因的常用方法有哪些?注：1 .基因文库构建方法反转录法直接分离法某种生物的全部DNA限制酶一定大小的DNA片段J与载体连接导入受体菌中储存基因蠡文库某种生物某时期的mRNAJ反转录单链互补DNAIdna聚合降双链CDNA片段J与载体连接导入受体菌中储存cDNA*文库2 .PCR技术原理：DNA复制前提：一段已知目的基因的核昔酸序列，以便根据这一序列合成引物条件：模板DNA（需含有目的基因）、
6、四种脱氧核昔酸（dNTP）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、一对引物、温度控制过程：a、DNA变性（90C95C）:双链DNA模板在热作用下,氢键断裂，形成单链DNAb、退火（复性55C65C）:系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部.双链c、延伸（70oC-75C）:在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DN大链。d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加二倍结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增3.PCR扩增技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相原理DNA复制（碱基互补配对）同原料四种游离的脱氧核甘酸点条件模板、ATP.酶、原料、引物不解旋方式DNA在高温下变性解旋
7、解旋酶催化同场所体外复制（PCR扩增仪）主要在细胞核内点酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子4.人工合成.反转录法:以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA（cDNA）,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获取所需的基因。.根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核甘酸序列，再通过化学方法，以单核甘酸为原料合成目的基因。探究二基因表达载体的构建问题1：为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传
8、？问题2:基因表达载体的构成包括哪些元件？（绘制基因表达载体的模式图）问题3:什么是启动子、终止子？各有什么作用？问题4:基因工程的运载体是否必须要有标记基因？问题5:怎样才构建基因表达载体？（填空）用一定的切割质粒，使其出现一个切口，露出o用切断目的基因，使其产生o将切下的目的基因片段插入质粒的处，再加入适量,形成了一个重组DNA分子（重组质粒）DNA分子M 种限制酿DNA连接傍lftffiDNA附图载体（质粒）DNA分子（含目的基因）-同一种限制酶切割带布黏性带有相同黏性末末端切口端的目的基因片段IIIDNA连接酶重组DNA（环状重组质粒）探究三目的基因导入受体细胞转化问题1：什么是转化？
9、问题2:比较将目的基因导入受体细胞方法?细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞一整合到受体细胞的DNA上一表达动物细胞将含有目的基因的表达载体提纯一取卵（受精卵）T显微注射一早期胚胎培养T胚胎移植一发育成为具有新性状的动物微生物用Ca?+处理细胞一感受态细胞一重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合f感受态细胞吸收DNA分子探究四步骤四：目的基因的检测与鉴定一检查是否成功问题1：受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？问题2.目的基因的检测内容和方法的比较类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞是否
10、成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质是否成功显示出杂交带个体水平鉴定问题3.试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些?问题4.B-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镶刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的B-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？拓展延伸分子杂交技术DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。基因探针基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标
11、记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件:应是单链，若为双链，必须先行变性处理。应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。反馈平台（勤练习，学方法）1、基因工程的操作步骤制备重组DNA分子转化受体细胞筛选出获得目的基因的受体细胞，培养受体细胞并诱导目的基因的表达获取目的基因正确的操作顺序是（）A.B.C.D.2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（）
12、从基因文库中获取目的基因反转录法A、B、3、下列属于获取目的基因的方法的是（利用mRNA反转录形成从受体细胞中提取利用DNA转录A.B.4、有关基因工程的叙述正确的是利用PCR技术扩增目的基因通过DNA合成仪利用化学方法人工合成C、）从基因组文库中提取利用PCR技术人工合成C.（ ）D、D.DA、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料5、下列关于限制酶的说法正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少B、一种限制酶只能识别一种特定的核昔酸序列C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D、限制酶的作
13、用部位是特定核甘酸形成的氢键6、己知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断,则从理论上讲，经该酶切割后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数线性DNA分子的蒯示趣A、3B、4C、9D、127、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达
14、8、下列关于基因工程的叙述，错误的是（）A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达9、下列关于基因工程的叙述，正确的是：（）A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B.细菌质粒是基因工程常用的运载体C.通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA,用另一种处理运载体DNAD,为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体10、采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是（）将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A、B、C
