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1、ICS65.020.30CCSB44实验动物学会团体标准T/CALASxxx-202x实验动物鸭甲型肝炎病毒3型检测方法1.aboratoryanimal-DetectionmethodforduckhepatitisAvirustype3ofducks（征求意见稿）202x-xx-xx 发布202x-xx-xx实施中国实验动物学会发布1刖S本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281
2、)技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：吉林大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本文件主要起草人：赵丽丽、陈洪岩、王玉娥。实验动物鸭甲型肝炎病毒3型检测方法1范围本文件规定了实验动物鸭甲型肝炎病毒3型的雏鸭接种、鸭（鸡）胚接种、原代鸭胚肝细胞接种、RT-PCR试验和荧光定量RT-PCR试验的技术要求。本文件适用于实验动物鸭甲型肝炎病毒3型的诊断及检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于
3、本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求NY/T554-2002鸭病毒性肝炎诊断技术OlE陆生动物诊断试验和疫苗手册2.7.93术语和定义以下术语和定义适用于本文件。3 .1鸭甲型肝炎病毒3型duckhepatitisAvirustype3,DHAV-3鸭甲型肝炎病毒3型引起雏鸭的一种急性、高度致死性的疾病，以肝炎为其主要特征。主要侵害3周龄以内的雏鸭，死亡率高，是近年来危害养鸭业最为主要的传染病之一。3.2Ct值CtvaIue每个反应管内荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。4主要材料与仪器3.1 材料和试剂3.1.1 研钵或平皿。4 .1.20.22m微孔滤膜。5 .1.
4、3高心管、手术剪刀和手术镜子。6 .1.40.85%生理盐水:在使用前加入青霉素和链霉素，使其最终浓度分别为2000IUmL和2000gmLo4.1.517日龄易感SPF雏鸭；1014日龄SPF鸭胚或8IoH龄SPF鸡胚。4.2仪器4.2.1富速台式冷冻离心机。4.2.2组织匀浆器。4.2.3PCR检测仪。4.2.4荧光定量PCR检测仪。5病料处理a）在无菌室内超净台上无菌采取数例病鸭的肝脏组织10g,于研钵或平皿中剪碎，用组织匀浆器制备组织匀浆,按L10（WV）加入生理盐水。将匀浆液移至离心管中，3000r/min离心IOnlin。弃去上层脂肪，抽取中间清亮液体，再经过0.22m的灭菌微孔滤
5、膜过滤，收集滤液，作为病料样品直接接种；或于-20保存待检，保存期不超过12个月。b）涉及生物安全的操作遵循生物安全相关规定，按实验室生物安全通用要求规定执行。6病原学检测试验（用下列一种或多种方法鉴定）6.1 把待检物皮下或肌肉接种的17日龄易感SPF雏鸭，出现特征性的临床症状，于接毒后1848h出现死亡，通常在24h内死亡。剖检可见病变主要发生在肝脏，肝脏肿大、有点状或斑状出血，也可能伴有明显的脾肿大、肾肿胀和肾血管出血。肝脏显微病变的特点是肝细胞广泛坏死和胆管增生，不同程度的细胞炎性反应和出血。6.2 将待检物作系列稀释后，接种于1014日龄SPF鸭胚或810日龄SPF鸡胚的尿囊腔内。鸭
6、胚于2472h后死亡。鸡胚通常在接种后58天发生死亡。胚胎的眼观病变为发育阻滞，全身皮下出血，伴有腹部和后肢部的严重水肿。胚肝呈红黄色肿胀并有坏死杜。死亡时间较长的胚胎中，尿囊液明显变绿，肝脏病变和发育阻滞会更明显。6.3 将待检物接种于敏感的原代鸭胚肝细胞（DEL）,引起的典型细胞病变为细胞变圆坏死,形成直径为Inim的蚀斑。7RT-PCR检测7.1 引物F：5,-TGATGCGAGTTGGTAAGGA-3,（上游）R：5-CCAACAACCATAATAGGGC-3,（下游）7.2样品的处理病料样品、鸡胚/鸭胚尿囊液、细胞上清液作为待检材料。每次检测设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为接种了D
7、HAV-37296h的SPF鸭胚（或鸡胚）尿囊液；阴性对照为健康SPF鸭（或鸡）胚尿囊液。7.3RNA提取按照RNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照的RNA。提取的RNA应立即进行检测，否则应于超低温保存。7.4RT-PCR反应按照一步法RT-PCR试剂盒说明书，配制RT-PCR反应体系，设定反应条件。第一步RT；第二步灭活反转录酶；第三步PCR,反应条件：451530min,94C25min,9430s,5245s,72lmin,35个循环，72C5mino7.5PCR产物的检测反应结束后，PCR产物于L2%的琼脂糖凝胶中电泳。每个样品的加样量为5IoHL,同时以DNA分子质量标准物为参照。
8、50V恒压电泳40min,置紫外灯下观察。7.6结果的判定阳性对照在87ObP处有一条特异的DNA条带，阴性对照没有条带，证明本实验成立。待检样品在相同位置出现DNA条带，判为阳性，否则为阴性。8实时荧光RT-PCR检测1.1 引物realtimeF：5,-ATAGAGCTTGGATACTTGGAAnGGT（上游）realtimeR：5,-TAGCCATTGGTTGAGTTGATAGT-3,（下游）TaqMan探针P：5-FM-CACTCGGCCCTTGTGTCCCTCTAAC-TMR-3,1.2 样品的处理和RNA提取同7.2和7.3中的规定。8. 3扩增体系的配制按照一步法qRT-PCR试
9、剂盒说明书，配制qRT-PCR反应体系。9. 4荧光RT-PCR扩增将8.3中离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，编辑样品表。设定反应条件：第一步RT；第二步预变性；第三步循环反应，反应条件：5515min,95C30s,9510s,6050s,40个循环。8.5结果判定8.5.1质控标准8.5.1.1阴性对照检测通道读取数据无CI值，且无特征性扩增曲线。8.5.1.2阳性对照检测通道读取数据出现特征性扩增曲线，且Cl值应W30。8.5.2结果描述及判定8.5.2.1阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无DHAV-3核酸。8.5.2.2阳性Cl值W35.0,且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在DHAV-3核酸。8.5.2.3可疑Ct值35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值W35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
