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1、非洲猪瘟病毒核酸检验标准操作规程全套1 .取样类别及处理方法疫苗1.Ll活疫苗取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份0.2ml,等量混合，取混合液进行核酸提取。1.1.2灭活疫苗取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。1.121 油佐剂灭活疫苗取36ml混合疫苗，加入正戊醇4.0ml,充分振荡混合1分钟，28。C冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。1.122 铝胶佐剂灭活疫苗取混合疫苗5.0ml,摇匀，加入0.25g解离剂CPG-Odn（人工合成的寡聚核甘酸），放入摇床（20OrPm）37解离1小时，500OrPm离心10分钟，取上清液进行核酸
2、提取。1.123 3其他水性佐剂灭活疫苗直接取混合样品进行核酸提取。1.124 生物制品和半成品冻干制品取至少2份（瓶）样品按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；液体制品及半成品取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。1.125 毒种取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。1.126 细胞除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。1.127 猪源原辅材料151猪组织每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮,
3、70灭活30分钟,4。C下以20003000g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。1.127.2 清每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。153猪胰酶干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。1.127.4 猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。3 .核酸提取（以商品化试剂盒为主）3.1 仪器、耗材PCR仪、台式离心机、旋涡振荡器、水浴锅、移液器（0.510K20200k100
4、-1000l）及配套吸头、1.5ml离心管、一次性口罩、一次性乳胶手套。3.2 操作方法按试剂盒说明书进行操作（注意：操作过程中应使用带滤芯的枪头且无核酸酶污染，每次吸取液体时更换枪头）。4 .核酸检测（普通PCR检测法）4.1 试剂和器材4.1.1 PCR试剂IOXPCR缓冲液（含25mmol/LMg2+）、DNA扩增酶、dNTP、扩增引物（上游引物：5-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3,;下游引物：5-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3,）、IXTAE、1.5%琼脂糖、Markero4.1.2 仪器PCR仪、微波炉、电泳仪（含水平电泳槽）、凝胶成相系统、移液器（0.51
5、0k20200k100-1000l）。4.1.3 耗材1.5ml离心管、0.2mlPCR管、无菌吸头（10pl、200pl、1000l）4.2 操作方法421反应体系的配制配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0l,在阴性对照反应管中加入2.0l无核酸醐灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：成分体积(l)10PCR缓冲液2DNA扩增酶1dNTP0.5PPA-I(10molL)1PPA-2(10molL)1DNA2无核酸酶灭菌水12.5总量20422反应程序将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中,按照以下程
6、序进行扩增：942分钟，94C30秒，60C30秒，7230秒，35个循环；72。CIo分钟。12保存。423PCR扩增产物电泳取PCR扩增产物6l左右，加6加样缓冲液2.0l,混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V,电泳时间30分钟左右。424染色电泳结束后，关闭电泳仪，戴一次性手套将凝胶取出，置于核酸染色液中，染色2030分钟。425凝胶拍照戴一次性手套将凝胶取出，置于凝胶成像系统水平平板中拍照，记录检测结果。4.2.2.5结果判定阴性对照应不出现257bp的特异性条带，阳性对照应出现257bp的特异性条带，该次检测结果成立。当待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带
7、，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性。扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。当待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。4.3清场检验剩余的样品、实验废弃物（枪头EP管等）可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。附注：1.lOOomIlXTAE的配制MX50TAE20ml,加入IoOOml容量瓶中用纯化水定容至100OmI,即得。2.1.5%琼脂糖凝胶板在盛有100ml1TAE缓冲液的锥形瓶中加入1.5g琼脂糖，用微波炉加热融化，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），即得。
