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1、实验二实验二 血红蛋白血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定及其衍生物的吸收光谱测定 目的要求目的要求u掌握掌握722型分光光度计的使用型分光光度计的使用u了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定u掌握血红蛋白标准曲线的绘制掌握血红蛋白标准曲线的绘制实验原理实验原理 溶液中的物质在光的照射激发下，产溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收
2、而减弱，光能量液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理系，也即符合于比色原理-朗伯朗伯-比耳定律比耳定律 u分光光度计的使用分光光度计的使用l 朗伯比尔定律：朗伯比尔定律：A=lc：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度：溶液的浓度 l：液层的厚度：液层的厚度 A：物质的吸光度：物质的吸光度 u比色皿的使用比色皿的使用 手持毛玻璃面，不可触碰光滑面手持毛玻璃面，不可触碰光滑面 使用前要再用少量（大约使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液）待测溶液润洗润洗1次次 使用时比色皿光滑面对准光路使用时比色
3、皿光滑面对准光路 使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用蒸馏水润洗蒸馏水润洗1-2次）次）u血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定 血红蛋白血红蛋白(Hb)与与O2结合生成结合生成氧合血红蛋白氧合血红蛋白(HbO2)，与，与CO结合生成结合生成碳氧血红蛋白碳氧血红蛋白(HbCO)。因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱
4、可作为它们定出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础。性和定量分析的基础。如如HbO2在可见光波长在可见光波长400600nm范围范围内有内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧处，当氧合血红蛋白转为碳氧血红蛋白（血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，），此时光谱发生改变，在波长在波长419、540和和569nm处出现三个特征处出现三个特征的吸收峰，其中在的吸收峰，其中在500600nm范围内范围内2个个特征的吸收峰如下图。特征的吸收峰如下图。项目项目吸收峰数吸收峰数吸收光谱（吸收光谱（nm）Hb
5、O22541 577HbCO2540 569仪器和试剂仪器和试剂 1仪器：试管；吸量管；仪器：试管；吸量管；量筒；量筒；722型分型分光光度计；光光度计；CO发生器。发生器。2试剂：试剂：（1）浓）浓H2SO4；（2）甲酸；）甲酸；（3）蒸馏水；）蒸馏水；（4）血红蛋白溶液。）血红蛋白溶液。（5）NaOH；实验操作实验操作u 预热仪器预热仪器 u 选定波长选定波长 u 调节调节T=100 u 调节调节“0”点点 u 测定测定 u 关机关机 分光光度计的使用分光光度计的使用 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。即制得全血。（1）氧合血红蛋白
6、（）氧合血红蛋白（HbO2）液：）液：加蒸馏水加蒸馏水20ml，取全血取全血0.1ml（3滴）盛于滴）盛于小烧杯中，混匀，此即小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。液，呈鲜红色。（2）碳氧血红蛋白（）碳氧血红蛋白（HbCO)液：液：取上述取上述HbO2液约液约5ml于试管中，通于试管中，通CO气体气体（浓硫酸与甲酸在（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约发生器中反应发生）约10秒钟，秒钟，HbO2即变成樱桃红色的即变成樱桃红色的HbCO溶液。溶液。1样品的制备样品的制备：2吸光度测定：吸光度测定：（1）将如上制备的）将如上制备的2种血红蛋白液分别种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在盛于比色杯
7、内，在722型分光光度计上以蒸型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一每一次读数均应用空白管调节零点和次读数均应用空白管调节零点和100%）。）。（2）先从波长先从波长500600nm分别测定分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的值的10nm范围内每隔范围内每隔2nm记录一次吸光度记录一次吸光度读数，其余均每隔读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读记录一次吸光度读数）。数）。3.吸收光谱曲线的绘制吸收光谱曲线的绘制 以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，
8、即为血红蛋白点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对收光谱必有一些差异，对722型分光光度计型分光光度计来说，峰值误差在来说，峰值误差在3nm5nm波长内是允波长内是允许的。许的。注意事项注意事项u 分光光度计应放在干燥处，使用温度为分光光度计应放在干燥处，使用温度为535。远。远 离强电场、磁场离强电场、磁场u 每次做完实验时，应立即洗净比色皿每次做完实验时，应立即洗净比色皿 u 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 u 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记 思考题思考题 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义？生物的吸收光谱有何意义？2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特征反映它的什么结构成分？特征反映它的什么结构成分？
