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1、早产儿脑白质损伤啮齿类动物模型研究进展2023摘要早产儿脑白质损伤动物模型在疾病发病机制和治疗研究中至关重要。通常采用啮齿类动物建模以模拟人类早产儿脑白质损伤的病理表现。目前常用的模型包括颈总动脉血流阻断与缺氧模型、产前/生后感染模型、慢性缺氧模型、高氧暴露模型、神经兴奋毒性模型和转基因模型等。本文对以上模型建模方法及其优缺点等进行综述。【关键词】脑损伤；白质；疾病模型，动物；婴儿，早产随着围产医学的快速发展，早产儿尤其是极/超早产儿存活率显著提高1-3,但早产儿脑损伤及其后遗症的患病率并未下降4-6o脑白质损伤(whitematterinjury,WMI)是早产儿脑损伤的常见类型之一，在脑性
2、瘫痪病因中占42.5%1o早产儿WMI的远期不良预后,如运动、感觉、认知功能障碍、神经行为综合征等后遗症，不但影响其生存质量，也给家庭和社会带来沉重负担7-8L早产儿WMI已成为国内外亟待解决的重大医学难题9o因此，针对WMI的发生机制、分子病理及药物研发等还需要深入探讨，而合适的WMI动物模型对于相关研究具有重要作用。WMl是各种病理因素如围产期感染、缺氧-缺皿hypoxia-ischemia,HI低氧血症、兴奋毒性等干扰少突胶质前体细胞正常髓鞘化和诱导少突胶质祖细胞选择性变性导致的脱髓鞘疾病1o啮齿类动物是WMI相关研究中最常见的模型动物，具有繁殖快、易饲养、成本低、操作便利等优势。大鼠的
3、皮层分裂清晰度、神经元易损性、大脑功能形态和发育程度以及耐损伤能力皆优于小鼠8,100在神经行为学研究中，大鼠还可模拟人类共济失调和步态失调等疾病状态口1L但在疾病分子机制研究中，转基因小鼠具有更高的灵活性10,12o神经损伤的病理表现及严重程度与大脑发育程度关系密切。人类胎龄2332周是WMI发生的高峰期。少突胶质前体细胞是该时期损伤机制的关键靶细胞，对常见的WMI诱因，如HL感染/炎症和低碳酸血症等具有易损性。生后第25天(P2P5,PO为出生当天)的啮齿类动物，其少突胶质细胞(oligodendr。CyteS,OLs)发育程度与人类早产儿相近,因此常被应用于WMl建模1,11,13o本文
4、将对目前常用的啮齿类动物WMI模型的建模方法和特点进行总结，为后续相关研究提供参考。一、颈总动脉血流阻断与缺氧模型Rice等14和Vannucci等15-16对Levine17设计的大鼠HI模型进行改良后建立的大鼠缺氧缺血性脑损伤模型应用广泛。该模型对乳鼠进行永久性单侧颈总动脉结扎后，再暴露于8%02的恒温箱中进行缺氧处理15,181为适配临床上HI所致的多种早产儿WMI类型，其他学者选用P2P5啮齿类动物并对手术方法和相关参数进行调整，如对乳鼠单侧颈总动脉近、远心端结扎并于中间切断血管进行动脉闭塞脑缺血处理19,或是对双侧颈总动脉进行血管两端可逆性结扎，于缺氧期后再解除结扎装置20o双侧颈总
5、动脉结扎相较于前2种方法对乳鼠所造成的脑损伤程度加重，造模时动物的病死率升高，但与人类缺氧缺血性脑病早产儿的病死率相近20L缺氧时间长短对WMI的范围以及严重程度具有不同效应。Chen等21发现损伤后脑容量减少、神经元结构紊舌轿口皮质水肿等情况均与缺氧时间呈正相关：对P3C57BL/6乳鼠右颈总动脉行可逆性动脉闭塞脑缺血处理,再置于缺氧室(10%02%02)中分组缺氧80、90或100min,结果表明乳鼠的月并脏体、海马体以及半球皮质萎缩程度随缺氧时间延长而逐渐加重，神经细胞核固缩以及脑神经元结构紊乱现象也更明显。其他学者对建模时的氧浓度(6%8%)以及缺氧时间(30.150或240min)进
6、行调整后发现，无论是从髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein,MBP)密度下降情况和炎症细胞增殖情况还是从脑水肿和出血面积来看，其WMI程度轻于较短时间、较低氧浓度建模，更符合目前临床上早产儿WMI的程度19,22-240啮齿类动物WMI程度存在高度可变性,与其遗传背景、品系和性别密切相关。相同条件HI处理后zC57BL6和129SVJ小鼠的脑损伤程度较轻，而CD1和FVB小鼠表现出更为严重的脑组织缺氧缺血性病理学改变，病死率却相同11,250WistarxSprague-Dawle/SD)fLong-Evans大鼠诱导皮质深层神经元损伤以及重度WMI时,所采用的条件存在差异：在缺
7、血处理后zLong-Evans大鼠需5.6%02持续缺氧120180min,SD大鼠需6%02持续缺氧2h,Wistar大鼠则需6%02持续缺氧30min26-29o该现象可能与各品系大鼠OLS的密度以及成熟时间不同有关30o选用不同品系啮齿类动物对于建模期限以及成本也有一定影响，考虑经济性、真实性是建模要点。就性别而言，雄性动物的脑白质易损性更强。相关研究表明，该现象可能与性别特异性激素、兴奋性氨基酸，以及细胞凋亡途径中的性别依赖性保护机制有关11,31o此类研究有助于后续针对性别采取不同治疗方案，或是根据性别特征性机制制订相应的治疗方案。二、产前/生后感染模型宫内感染是早产以及胎儿侧脑室周
8、围白质软化发生风险增加的重要原因之一，与11%40%的早产事件相关,宫内感染胎儿侧脑室周围白质软化发病率是健康胎儿的3倍32-33L建立产前感染模型主要采用以下3种炎症反应进行诱导。第一，孕15d(E15)母鼠腹腔注射0.05mg/kg大肠埃希菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)z模拟最常见的产前感染所致WMI动物模型；乳鼠脑组织表现出OLS损伤并丢失，MBP表达降低，髓鞘形成障碍，神经细胞凋亡，小胶质细胞活化现象增加，促炎细胞因子如白细胞介素(interleukin,IL)-1JL-6和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-。表达水平升高34-
9、35o第二，E8、E10、E12的Wistar孕鼠腹腔注射0.009mg/kgIL-6,乳鼠海马结构形态和成年后的学习记忆能力发生异常36o第三,不同孕期母鼠尾静脉注射0.5mg/kg聚肌胞苗酸，可引发抗病毒样免疫反应37-3803种方法选用不同的炎症反应诱导物模拟临床上不同WMl的病理、临床表现以贴合研究目的。细胞因子表达增加不仅是损伤作用的表现，对于感染的诊断和预后预测也可能起重要作用。动物实验表明，不同孕期感染的母鼠的子代表现出的行为能力缺陷存在一定差异：E9、E17的C57BL/6孕鼠单次尾静脉注射0.5mg/kg聚肌胞苜酸可分别诱导乳鼠特异性感觉运动功能性分离和记忆障碍38o针对该结
10、果，推测不同胎龄的WMI患儿,其神经系统后遗症类型以及严重程度与感染时间有关，感染越晚导致的损伤程度可能越轻。生后感染模型中，LPS诱导的WMI最为常见。感染诱导物及其剂量和给药方式不同，可呈现不同的脑损伤病理改变。第一，给予P2P5SD乳鼠单次腹腔注射2mg/kg的LPS可诱导最常见的感染后所致WMI动物模型，除常规的脑组织WMI病理改变外,乳鼠的感觉、运动功能障碍、记忆和应激反应能力严重受损39-410第二,除常规的腹腔注射外，P3SD乳鼠脑内注射LPS后，其OLS髓鞘化障碍和白质选择性易损性增高42-43oP4CD1雄性小鼠硬膜下注射5或IOng的人IL-6,可诱导轻度急性神经炎症和运动
11、行为能力缺陷44o第三，P3BALB/c小鼠皮下注射106菌落形成单位的活K-12大肠杆菌，可阻碍其脑内的OLs成熟、白质发育以及成年后运动协调性的形成45o间歇性或持续性全身炎症可能比急性炎症对脑的损伤更大。P3C57BL/6小鼠连续9d腹腔注射0.3mg/kgLPS,或是向E17Wistar孕鼠连续腹腔注射02mg/kgLPS直至PO,结果发现乳鼠脑内氧化应激损伤增强，促炎细胞因子高表达，脑白质细胞凋亡、OLS成熟障碍、髓鞘缺失以及运动行为能力缺陷较对照组增加46-470此外,乳鼠连续5d腹腔注射0.01mg/kgIL-1或5mg/kgToll样受体-2激动剂Pam3CSK4,其髓鞘形成和
12、OLS成熟障碍，胶质细胞增殖并活化,MBP密度显著下降，记忆能力和物体识别功能受损48-49o综上所述,不同感染途径和不同炎症反应诱导物及其剂量对于模型WMI的影响不同，但可能集中表现为远期神经系统后遗症，如脑性瘫痪和认知行为障碍等。感染与HI的协同作用对动物WMI具有两面性。感染诱导的炎症因子可降低HI的损伤阈值。Wang等50予P2SD乳鼠腹腔注射低剂量（0.05mg/kg）LPS3h后进行右侧颈总动脉永久性结扎及缺氧（6.5%02）90min处理，结果发现与单独HI组相比，脑中胶质细胞活化增生、脑髓鞘化降低、侧脑室水肿程度较重，并呈选择性WMIo感染对HI后WMI的神经保护作用与处理时间
13、间隔相关。Eklind等51对P4Wistar乳鼠行单次腹腔注射03mg/kgLPS,间隔不同时间再实施左颈总动脉可逆性动脉闭塞脑缺血，随后缺氧（7.7%02）20或50min,结果发现LPS与HI处理之间间隔2h不会影响中枢神经系统的敏感性，间隔4、6和72h皆使白质易损性增加，而间隔24h的乳鼠WMI程度降低，表现为神经保护作用。LPS对HI后WMI的作用可能与诱导时脑发育特异性以及皮质酮水平有关52-53o急性或慢性感染后实施HI对于WMI程度的影响较大，可模拟临床上多因素致病的情况，但该模型对建模者的操作要求高，实验成本也增加。以上感染模型的可重复性和成功率均较高，但仍存在建模时间长、
14、动物死亡率较高等局限性。三、慢性缺氧模型慢性持续性缺氧和慢性间歇性缺氧模型通常用于模拟先天性呼吸系统、循环系统障碍所致WMI18o常见慢性持续性缺氧的操作为,将P3乳鼠置于缺氧箱(10%1.5%02)中，维持410d不等，可使乳鼠皮质神经胶质密度和体积降低，神经发育障碍和后期行为能力缺失54-560有学者采用更长的缺氧时间(2830d)模拟重度WMI57-59o但有研究认为，就MBP表达和髓鞘形成的延迟效应来看，较短的持续缺氧时间(4-5d)可充分诱导类似于长时间缺氧(Wd)所致的WMIe此外，适当缩短缺氧时间还能排除其他营养缺陷性因素的影响。乳鼠的饲养环境,如更换母鼠哺乳，对于其WMI程度有
15、加重趋势600慢性间歇性缺氧较慢性持续性缺氧而言,可模拟更严重的WMIoCD1乳鼠P2时开始持续4周的慢性间歇性缺氧每日11%02持续4min+21%02持续4min循环），与慢性持续性缺氧比较，在神经元功能和完整性方面表现出更显著的易损性61o通过改变缺氧浓度、时间或缺氧后的常氧暴露时间等条件可以实现慢性间歇性缺氧WMI动物模型的多样化。Gutziet等62对PlSD乳鼠进行持续5d的每日3次、每次缺氧（5%02）10min的慢性间歇性缺氧建立远期神经功能显著衰退的WMl模型。Darnall等63JiS过程序化慢性间歇性缺氧（每日6%02持续3min+21%02持续7min循环1hg强之21
16、%O2持续1h的交替模式,持续IOd）使乳鼠发生轴突损伤、胶质增生以及神经髓鞘化障碍。而BoUSlama等64采用每日8%02持续6h+20.8%02持续2h循环，持续5d的慢性间歇性缺氧以探究其保护作用。兴奋毒性脑损伤组（侧脑室注射10g鹅膏蕈氨酸）的P5乳鼠在经历慢性间歇性缺氧后，其脑组织病变范围缩小，记忆损害缓解；正常对照组施行早期适度的慢性间歇性缺氧，可促进乳鼠海马齿状回细胞增殖和神经发生，其记忆能力也得到提升。上述研究表明慢性间歇性缺氧能诱导WMI,但对侧脑室注射鹅膏蕈氨酸后的脑损伤又具有一定的神经保护作用。因此，慢性间歇性缺氧导致神经系统损伤还是促进损伤后修复存在不确定性。四、高氧暴露模型高氧暴露是发生WMI的原因之一65o有研究显示，P3乳鼠暴露于高
