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1、四J11省新冠病毒核酸检测操作规范（试行）为贯彻落实国家卫健委关于进一步加强新冠病毒核酸检测全链条监管的通知（联防联控机制综发（2022）63号）精神，实现全省新冠病毒核酸检测实验室流程标准化、同质化，快速协同，特制定四川省新冠病毒核酸检测标准操作流程和记录表格，推广全省开展新冠病毒核酸检测的实验室应用。一、新冠病毒核酸检测资质（一）实验室资质。开展新冠病毒核酸检测医疗机构应取得二级生物安全实验室及临床基因扩增实验室备案。（二）技术人员资质。L新冠病毒核酸检测人员。新冠病毒核酸检测人员应当具备相关专业的大专以上学历或具有中级及以上专业技术职务任职资格，并有2年以上的实验室工作经历，并经理论和实
2、践培训取得临床基因扩增或新冠病毒核酸检测培训合格证书（证书在有效期内）。实验室配备的工作人员应当与所开展新冠病毒核酸检测的样本量相适宜，以保证及时完成检测和结果报告。2 .新冠病毒核酸检测辅助人员。新冠病毒核酸检测辅助人员主要从事新冠病毒核酸检测相关的样本签收和前处理、协助核酸提取、样本打包保存、试剂耗材拆封等工作。新冠病毒核酸检测辅助人员应具备医疗卫生相关专业技术职业资格，上岗前应进行生物安全、信息系统使用、样本核收、样本保存等相关理论和实践培训，考核合格并取得新冠病毒核酸检测培训合格证书。二、新冠病毒核酸检测程序（一）检测系统的选择。新冠病毒核酸检测系统由采样管、核酸提取试剂、核酸提取仪、
3、核酸扩增试剂、核酸扩增仪等组成。L采样管。应选择具有病毒灭活功能如含胭盐（异硫氟酸朋I或盐酸服等）或表面活性剂的采样管，并根据国家规定的应用场景选择单采管，10混或20混采样管。发热门诊或急诊的快速检测系统，应根据所用核酸检测试剂说明书选择配套的采样管。3 .核酸提取试剂及仪器。宜选择核酸扩增试剂配套或推荐的核酸提取试剂，建议首选磁珠法核酸提取试剂。根据样本量和实际情况选择与核酸提取试剂配套或兼容的、不同通道（16通道，32通道，48通道，96通道等）、不同自动化程度（半自动、全自动）的核酸提取仪。4 .核酸扩增试剂及仪器。应选择国家药品监督管理部门批准至少检测ORFlab和N基因的新冠病毒核
4、酸扩增试剂，最低检测限应W500copiesml,优选W300copiesmlo实验室应选择至少两种扩增试剂，分别用于初检和复核。患者样本检测应选择内源性内标的核酸扩增试剂，环境样本检测应选择外源性内标的核酸扩增试剂。建议选择与核酸扩增试剂配套或推荐的核酸扩增仪，并根据检测样本量选择不同通量（48通道、96通道）核酸扩增仪。（-）性能验证或确认。在用于临床样本检测前、在仪器重大维修或搬迁后，实验室应对新冠病毒核酸检测系统进行性能验证（配套系统）或确认（非配套系统）。验证/确认的性能指标应至少包括最低检测限和精密度（至少要有重复性），并完成新冠病毒核酸检测系统性能验证/确认报告（模板见附件Do1
5、 .最低检测限。对于配套系统，使用定值标准物质，用实验室采样保存液稀释至厂家声明的最低检测限浓度，重复测定5个该浓度样本或在不同批内重复测定20个该浓度样本（如连续测定5天，每天测定4份样本）。判断标准为，5个检测结果都须检出靶基因，20个检测结果，须至少18个检出靶基因。对于非配套系统，使用定值标准物质，用实验室采样保存液稀释至核酸扩增试剂厂家声明的最低检测限浓度及附近的3-5个浓度梯度，每个浓度梯度做20个样本，至少18个检测检出靶基因的最低核酸浓度为实际最低检测限或通过PrObit分析确认最低检测限。判断标准为实际最低检测限W500copiesml（建议300copiesml）。2 .精
6、密度（重复性）。应至少评估弱阳性和中浓度两个水平的重复性。弱阳性水平用定值标准物质或定值质控品稀释至检测限L5-3倍浓度水平，中浓度水平建议稀释至IOOo-2000COPieS/nil。将两个水平的各10个样本按标准操作程序进行新冠病毒核酸提取和扩增，在质量控制达到要求的基础上，分别计算两个水平的CT值变异系数，判断标准为是否达到厂家声明的变异系数。检测系统通过性能验证或确认后方能用于临床样本的检测。更换试剂批号时，建议分别重复检测5个最低检测限浓度和5个弱阳性水平的样本，对新批号试剂的最低检测限和重复性进行验证。新批号试剂应通过性能验证后，方能用于标本检测。（三）核酸检测操作流程。新冠病毒核
7、酸检测流程通常包括试剂配制、样本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果判读和结果报告，必要时还包括结果复核。建议各实验室参照本操作流程，结合实验室实际使用的仪器设备和试剂耗材制定具有可操作性的标准操作流程。核酸检测和辅助人员在首次进入实验室操作前，必须通过标准操作流程的培训和考核后方能授权上岗。实验室所有检测人员和辅助人员都必须严格遵照标准操作流程进行核酸检测。L试剂配制（一区）。1）负责试剂配制的人员应根据待检样本数量、试剂盒规格（如：32T,48T,96T等）、质控数量、拟复查数量等信息测算试剂用量，现配现用。2）将测算数量的核酸扩增试剂盒从冻存冰箱中取出，扩增酶和反应混合液放常温解冻，将阳性和
8、阴性质控传递到二区待用或丢弃。3）待扩增酶和反应混合液完全解冻后，用移液器将试剂转移至无菌容器充分混匀，根据试剂盒说明书将混匀的试剂用移液器或自动化设备分装至8连管或96孔PCR反应板,并检查试剂液面的一致性。将8连管盖上管盖，96孔PCR反应板贴封口膜，以保证试剂在使用前无挥发、无污染，然后传递至核酸提取（二区）或暂存4。C冰箱备用。如实验室计划保存预装8连管或96孔PCR反应板，应验证预配试剂在保存温度和时间条件下，其性能指标的稳定性，否则应现配现用。4）在新冠病毒核酸扩增试剂配制记录表（模板见附件2）中，填写配制试剂的品牌和批号、配制日期和时间、配制数量和人员等信息。同时，将上述试剂信息
9、填写新冠病毒核酸检测流程记录单（模板见附件3）,并传递到样本前处理区。建议实验室针对每一批号试剂预制新冠病毒核酸检测流程记录单。2 .样本前处理（样本接收区或二区）。1）样本接收人员与样本运送人员核对样本信息，双签字确认样本数量等信息。样本接收数量不能超过实验室要求报告时间内的最大检测能力。2）样本签收人员应采取二级个人安全防护，在生物安全柜或负压实验室打开样本转运箱、消毒、检查样本包装是否有漏液等不合格情况。3）签收人员将初判合格的样本拆袋，震荡混匀，扫描采样管上条码编号录入实验室信息系统，并将扫码签收后的样本在96孔样本架上依次排放，静置10分钟，防止气溶胶的形成。同时，将检测板号、样本布
10、板信息填写在新冠病毒核酸检测流程记录单上，随样本一起进入核酸提取环节。4）在样本初判和签收过程中识别到漏液、无拭子、无条码、重码、条码模糊、条码横贴等不合格样本，应填写新冠病毒核酸检测不合格样本登记表（模板见附件4）,并第一时间通知运送和采样机构（部门）相关人员。漏液样本应统一消毒、收集，按医废流程处理，重新采样检测，其他不合格样本建议妥协接受并检测。3 .核酸提取（二区）。1）用记号笔在提取预装板和洗脱预装板正侧面标注检测板号，然后在生物安全柜内，按照核酸提取试剂说明书的加样体积，将排架样本按新冠病毒核酸检测流程记录单的顺序用移液器加入核酸提取预装板。也可用自动分杯加样系统，其操作程序见仪器
11、设备说明书。2）样本加完后，再加3个阴性质控（建议生理盐水、采样管保存液、或二区生物安全柜/核酸提取仪环境监测样本）和1个第三方弱阳性质控。加样过程注意核对样本顺序和加样量，切忌漏加、错加、多加或少加。3）根据核酸提取仪说明书，正确安装洗涤板、洗脱板、磁套，将加完样本的核酸提取预装板放入核酸提取仪相应位置并确认。如核酸提取仪有复位功能，点击复位按钮，核对并运行核酸提取程序。如实验室使用全自动核酸提取系统，其操作程序见仪器设备说明书。将新冠病毒核酸检测流程记录单放置核酸提取仪旁，并确认核酸提取仪正常运行。4）提取程序运行完成后，将核酸洗脱板从核酸提取仪拿出，在生物安全柜内根据核酸扩增试剂说明书的
12、加样体积，通过移液器（如：8通道，12通道）或自动化加样设备将提取的核酸加至8连管或96孔PCR反应板，检查液面的一致性。5）将8连管盖上管盖/或96孔PCR反应板封膜，瞬时离心（离心时注意8连管的位置顺序和离心机配平），然后连同新冠病毒核酸检测流程记录单传送至核酸扩增区。6）从核酸提取仪取出废弃预装板，用封口膜密封后丢弃。建议将原始标本和核酸洗脱板封膜保留至报告发放后，阴性标本和核酸洗脱板按医废处理，阳性标本按要求送当地疾控中心或在实验室保存至规定时间后高压处理。4 .核酸扩增（三区）。1）根据所用核酸扩增试剂说明书，设置荧光PCR仪的扩增程序，并以核酸检测项目、扩增试剂品牌和类型（如常规、
13、快检等）命名扩增程序文件，方便调用（如：新冠-XX品牌-常规）。2）选择对应的扩增程序，在荧光PCR仪样本编号界面输入新冠病毒核酸检测流程记录单上的标本编号和质控类型，保存该扩增批文件到月度文件夹，方便查找。建议扩增批文件命名方式为：核酸检测项目-扩增试剂品牌年月日-批次（样本号段）（如：新冠-XX品牌-20221123-P8（0101-0192）。3）确认8连管盖紧或96孔PCR反应板封口膜完全密封后将其放入荧光PCR仪，并核对扩增批文件中的样本位置和信息与新冠病毒核酸检测流程记录单一致后，运行扩增程序，同时确认荧光PCR仪开始正常运行。4）扩增程序结束后，及时将荧光PCR仪中的8连管或96
14、孔反应板取出，放入黄色医废袋外送集中处理。切勿在实验室内打开管盖/封口膜、或进行高压处理，以防止PCR扩增片段污染实验室。5 .扩增结果判读。1）扩增程序结束后，参照荧光PCR仪操作手册，运行扩增数据分析程序，并评估分析结果。如程序自动设置的基线和阈值不合理，则需手动调节。其中，基线设定原则：a.基线起始循环数应避开扩增开始时不稳定的几个循环，b.基线结束循环数应在指数扩增期前，c.基线应选择比较平坦区域；阈值设定原则：a.阈值一般置于扩增曲线的指数扩增初期，b.阈值荧光信号高于阴性质控。2）查看三个阴性质控扩增结果，内标是否有典型扩增曲线（外源性内标试剂有典型扩增曲线，内源性内标试剂应无扩增
15、曲线），靶基因是否有扩增曲线，综合评价阴性质控是否在控。3）查看弱阳性质控孔扩增结果，内标是否有扩增曲线（视第三方质控品而定），靶基因是否有典型扩增曲线，靶基因CT值是否在可控制的范围，评价弱阳性质控是否在控。4）查看所有样本的内标扩增曲线，判断是否有内标离群和内标未起的情况，评价采样质量和检测质量。5）三阴一弱阳性质控在控，被检标本内标有典型扩增曲线，无离群CT值，靶基因无扩增曲线，可判读为阴性结果。6）三阴一弱阳质控在控，排除采样（疫苗/环境）污染,排除实验室（阳性样本/弱阳性质控/扩增产物）污染，排除非特异信号，被检标本靶基因呈典型扩增曲线，可判读为阳性结果，并报告CT值。7）三阴一弱阳
16、质控在控，被检标本单靶基因有扩增曲线，则根据试剂盒说明书进行判读。如果此单靶基因阳性可报告新冠病毒核酸阳性，在双样本、双试剂复查阳性后可报单靶标阳性及CT值。8）如出现失控（阴性出现扩增、弱阳性无扩增、所有标本内标无扩增或大量离群），根据原因分析，去除原因（如核酸污染、质控品降解、仪器故障等）后，应采用原提取核酸或原始标本对该批次进行复查。如个别标本内标无扩增或离群，单靶基因阳性、弱阳性、异常扩增曲线、阳性结果，可采用原提取核酸、原始标本，必要时重新采样，双试剂复查。具体原因和复查方案可参照下表：新冠病毒核酸检测复查方案复查情况可能原因复查方法内标无扩增标本采集问题重新采集标本标本内有抑制物分析原因，稀释复查样本未充分混匀分析原因，充分震荡混匀后重新提取核酸提取问题分析原因，重新提取
