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1、目的研究红薯康王5号的组培脱毒方法及脱毒检测技术。方法以红薯康王5号植株为材料，使用不同培养基对红薯康王5号茎尖培养，筛选出最佳诱导分化培养基，培养后获得脱毒红薯康王5号植株。通过指示植物检测法，对组培红薯不定芽叶进行病毒检测。结果表面消毒效果最佳的方法是通过用自来水冲洗20分钟，在75%的乙爵中处理30s,用0.1%的升汞浸泡10分钟后，再用无菌水冲洗8次的消毒方式，它能取得较好的灭菌效果并降低污染率；最佳诱导愈伤分化培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA),愈伤诱导率可达92.3%；最佳诱导不定芽分化的培
2、养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.2mg/L蔡乙酸(NAA)+0.5mg/L茉氨基喋吟(6-BA)+0.25mg/L赤霉素(GA3),不定芽诱导率可达92.3%；最佳诱导不定根分化的培养基是MS基本培养基+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.1mg/L蔡乙酸(NAA)+0.4mg/L芾氨基口票吟(6-BA),不定根诱导率可达84.6%；病毒检测结果表明组培红薯不定芽脱毒率为80%,脱毒效果符合预期。结论为红薯康王5号脱毒苗工厂化生产提供理论依据和技术支撑。关键词：红薯；茎尖；脱毒；病毒检测；指示植物检测法AbstractObjectiveTostudythemeth
3、odanddetectiontechnologyofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5.MethodUsingtheIpomoeabatatasLamKangwang5plantasthematerial,thebestinduceddifferentiationmediumwasselected,andthevirus-freeIpomoeabatatasLamKangwang5plantwasobtained.TheleavesofIpomoeabatatasLamweredetectedbyindicatorplantdetection.ResultsThebes
4、tmethodforsurfacedisinfectionisbywashingwithtapwaterfor20minutes,Wastreatedin75%ethanolfor30s,After10minutesofimmersionin0.1%litersofmercury,Thenrinsing8timeswithsterilewater,Itcanachieveabettersterilizationeffectandreducethepollutionrate;ThebestinducedcallusdifferentiationmediumwasMSbasicmedium+30g
5、/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysinopurine(6-BA),Calliinductionratecanreach92.3%;TheculturemediumforoptimalinductionofbuddingdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.2mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)+0.5mg/Lbenzysamoprine(6-BA)+0.25mg/Lgibberellin(GA
6、3),Theinductionrateofadventitiousbudcanreach92.3%;ThebestmediumtoinduceadventitiousrootdifferentiationwasMSbasicmedium+30g/Lsucrose+6.0g/Lagar+0.1mg/Lnaphthaleneaceticacid(NAA)0.4mg/Lbenzysinopurine(6-BA);Thevirustestresultsshowedthatthedetoxificationrateofhistculturesweetpotatowas80%,Thedetoxificat
7、ioneffectwasinlinewithexpectations.ConclusionProvidetheoreticalbasisandtechnicalsupportforthefactoryproductionofIpomoeabatatasLamKangwangNo.5virus-freeseedlings.Keywords:IpomoeabatatasLam;stemtip;detoxification;virusdetection;indicatorplantdetectionmethod摘要IABSTRACTII1 .绪论11.1 红薯价值以及常见病害和危害11.2 植物脱毒
8、技术研究进展11.3 植物病毒检测方法进展21.4 课题研究目的、内容和意义32材料与方法42.1 材料42.1.1 材料42.1.2 试剂耗材42.1.3 仪器工具42.2.1 不同消毒方式的比较42.2.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导影响52.2.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化影响52.2.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化影响62.2.5 脱毒效果检测方法63结果与分析83.1 不同表面消毒方法对茎尖染菌率的影响83.2 不同激素浓度配比对红薯茎尖愈伤组织诱导的影响83.3 不同激素浓度配比对红薯不定芽分化的影响103.4 不同激素浓度配比对红薯不定根分化的影响H3.
9、5 脱毒检测结果124讨论及结论144.1 讨论144.2 结论14攻读学位期间的研究成果16参考文献17致谢191.绪论1.1 红薯价值以及常见病害和危害红薯(IPomoeabatatasLam.)又名地瓜、红苕、朱薯、红芋等，属旋花科，一年生或多年生草本块根植物。红薯是我国主要且高产的粮食作物之一，其营养丰富。富含多糖、胡萝卜素、膳食纤维、花青素、维生素和钾、铁、铜、硒、钙等10余种微量元素以及8种氨基酸，被誉为最均衡的健康食品，同时它也是重要的工业原料及饲料。红薯属于碱性食品，吃红薯有利于人体的酸碱平衡。同时吃红薯还能降低血胆固醇，防止心脑血管病等“现代病”。随着红薯低糖、低热、低脂肪的
10、营养学特性及抗癌保健作用被消费者认知，世界范围内的“红薯热”日盛一日，使红薯种植业与加工业都有了快速发展*!未找到引红薯适合在高温、短日照的环境下种植和生长，它的适应性强，抗逆性强，节水耐瘠薄，而且产量比较稳定。然而，在实际生产中，红薯会受到病虫害的感染。红薯的主要病害有：黑斑病、薯瘟病、软腐病、藤切病、根腐病和病毒病，其中病毒病对红薯的影响很大。目前，影响红薯作物生长的病毒病有30多种。而产生病害、影响红薯质量和产量的主要因素是病毒。其中以羽状斑点病毒(SPFMV)、潜伏病毒(SPLV)、静脉病毒(SPVMV)和G病毒(SPVG)为主，还有两种或多种病毒的混合感染叫据统计，红薯感染病毒后，一
11、般情况下会减产20-50%,每年可产生高达几十亿元的经济损失。因为红薯一旦被病毒病感染，往往会导致其产量、质量和种性发生退化。1.2 植物脱毒技术研究进展植物脱毒的方法主要有：茎尖组培脱毒、热治疗脱毒、病毒抑制剂与茎尖组培相结合脱毒、茎尖组培和热治疗相结合脱毒等。茎尖组培脱毒。茎尖组培脱毒是目前最安全、最有效和最重要的生产无病毒植物的方法，因为它的脱毒效率高而且后代的遗传稳定性比较强。这项技术在国内外早已广泛应用，其中我国在马铃薯、红薯、花卉等植物上应用了此种脱毒方法，并取得了显著的成效。热治疗脱毒。它的基本原理是使病毒失去原本活性，导致植物体内的病毒含量不断降低。因为植物中某些病毒颗粒受热之
12、后会有一定的不稳定性，所以病毒可以使用热处理的方法进行脱毒处理。在经过一段时间后，病毒会慢慢变少，最后自行消失。不同植物，不同品种和不同植物病毒对温度的敏感程度有很大差异。所以针对这种情况，热处理的方法也不同。常用的方法有：（1）热风处理法。（2）温汤浸渍法。这两种方法简单易操作，但容易导致植物材料受损。此外，植物长时间进行热处理，具有钝化植物组织中的阻抗因子的作用，导致植物的抗病毒因子失活。所以，热处理方法的主要缺点是，可能会使植物材料受损，且并非能去除所有的病毒。例如，在马铃薯中，这种技术只能消除卷叶病毒。病毒抑制剂和茎尖组培相结合脱除病毒。即在采用茎尖组培脱毒时，在培养基中加入适量的病毒
13、抑制剂。在不影响植物离体组织生长的情况下，使茎尖中的病毒被抑制，从而使再生的植物组织不含病毒。常用的病毒抑制剂包括孔雀石绿、2,4-D和三醇核营等。其原理是利用病毒抑制剂对病毒的抑制作用。例如，在补充有三哇醇核苜的培养基中培养的马铃薯茎尖能有效地剥离PVX和PVSo茎尖组培和热治疗相结合脱毒。研究表明，如果植物本身带毒较多且此种病毒难以去除，只采用茎尖脱毒这种方法很难完全去除病毒。如果结合热治疗脱毒的方法，可以有效地去除植物中存在的病毒。因此，先进行热治疗处理脱毒，使植物的茎尖基本无毒，再采用茎尖组培方法进行脱毒。1.3 植物病毒检测方法进展常用的植物病毒检验方法有生物学方法、血清学方法、电镜
14、观察方法以及分子生物学方法中的核酸分子杂交技术、双链RNA电泳技术、聚合酶链式反应技术（PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR,多重PCR,巢式PCR）、核酸序列扩增技术、环介导等温扩增技术等。目前红薯病毒的检测方法主要有：（1）症状学诊断法，这种检测方法会受植物不同品种、植物不同生长阶段、植物所在环境因素被限制影响，且植物病毒的隐性症状不容易被检测发现。（2）血清学检测法，这种方法的检测结果是比较准确的。但红薯植物体内存在多种病毒，且几种病毒常常交叉感染。如果采用试剂盒进行诊断，很难判断和检测。正常情况下，检测多种病毒的诊断试剂盒也不易制作。如果病毒没有交叉感染，诊断试剂盒检测病毒的这种方
15、法是可以实现的。但这种脱毒方法适用于大样本，需要的成本也较高。（3）电子显微镜检测法，这种检测方法是目前最理想的检测法。它是一种能够定性检测植物病毒的方法。但这种检测方法技术难度比较大，除了需要专用设备，还需要有专业的技术人员操作设备，要求通常较高。（4）分子生物学检测法，具有准确性高、灵敏度高的特点。但涉及分子方面的实验，采用的技术和方法要求都是比较严格的。它需要有专用实验设备，专业的技术操作人员。实验过程中，各种试剂、试剂耗材和试剂盒成本也很高。(5)指示植物检测法。研究证明，指示植物法的检测结果是比较准确。它的实验过程简单，且实验步骤容易操作。在结果检测时也不需要昂贵的仪器设备，相比于其
16、他几种红薯病毒检测的方法，其成本较低。JamesJohnSOn早在1925年就开始用指示植物鉴定植物病毒。生物学检测法又叫指示植物检测法0o指示植物检测法是植物病毒检测和鉴定的传统方法。其结果可以不使用任何实验设备，用肉眼直接进行观察。此种方法进行的鉴定结果也是比较可靠的，它不仅能准确地反映病毒的生物学特性，而且能够检测出植株体内的未知病毒。目前在国内外都有广泛应用，例如李春敏用黄瓜为指示植物鉴定核果坏死环斑病毒(PNRSV)6。1.4 课题研究目的、内容和意义红薯的种植非常广泛，对当代人民产生巨大经济效益的同时，食用后对人体也有一定的抗癌保健作用。然而，在实际生产中，红薯会受到病毒的感染。基于此，要对红薯植物进行脱毒。在对红薯进行脱毒时，选择的脱毒方法要保证脱毒后，并不改变红薯
