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1、黑斑侧褶黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范1范围本文件规定了黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范。本文件适用于黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法中国微生物菌种保藏管理条例3术语与定义3. 1毁髓法pithing毁髓针刺入蛙枕骨大孔后，将针后端压平,水平向前进入蛙颅腔,左右摆动，捣毁双侧脑组织脑脊髓。4
2、. 2PCRPolymeraseChainReactionPCR是在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是由于高温变性、低温退火等反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以快速进行扩增。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下：4.1 无菌采样袋或商品化采样棉拭子、剪刀4.2 一次性接种环4. 3无菌培养HH：90mm4.4 微量加样器：lL,2.5L,10L,100L和IOooL4.5 TiP头（与微量加样器相匹配）4.6 1.5ml无菌离心管4.7 有冷藏（4C）和冷冻（-20C）功能的冰箱4.9 手持式均质器：适用于L5矶离心管4. 10电子天平：最小刻度0
3、.0Ig4.11 显微镜（100o倍）4.12 高速冷冻离心机（212000rmin）4.13 恒温水浴锅4.14 PCR仪4.15 电泳仪4.16 自动凝胶成像系统4.17 涡旋仪5. 18微波炉4.19无菌工作台5培养基和试剂除特殊说明，所有实验用水应符合GB/T6682规定的三级水5. 1营养肉汤（附录）5.2非选择性细菌培养基（附录）6. 3DNAMarker：1Kb6.1 扩增片段长度及引物16SrDNA扩增片段长度：约150ObP上游引物序列：27f5-AGAGTnGATCCTGGCTCAG-3下游引物序列：1492r5-GGTTACCnGTTACGACTT-3gyrB扩增片段长度
4、：约120ObP上游引物序列：gyrB3F5-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3下游引物序列：gyrB14R5-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-36.2 灭菌生理盐水:0.6%6.3 IOXPCR缓冲液6.4 Taq聚合酶（0.5UL）6.5 dNTPs（2mmol）6.6 1.2%琼脂糖凝胶（附录）6.11 IXTAE缓冲溶液（电泳缓冲液）（附录）6.12 核酸染料：GelRed6分离与鉴定技术流程7操作步骤7.1采样病蛙采集回实验室后，用清水清洗蛙体，置无菌操作台紫外线灭菌待用；将病蛙置于冰水混合物中低温麻醉或对病蛙进行毁髓法操作；待病蛙完全进入麻醉或死亡状态后，取出病
5、蛙，用吸水纸吸去体表水分；用酒精棉球（75%消毒酒精）对病蛙体表和眼部消毒；将杀菌消毒后的病蛙置于无菌操作台内的托盘上，选取眼部病变明显处，用镶子和手术剪刀进行采样。1.2 病菌的培养在无菌状态下将所采病变组织进行剪碎或匀浆：将剪碎或匀浆后的组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36C1）培养24h,观察；将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌非选择性培养基中，恒温培养箱（36C1C）培养24h,观察；选取可疑菌落接种于新的无菌非选择性培养基中，温培养箱（36C1C）培养24h,待进一步鉴定。1.3 病菌样品的鉴定7. 3.1形态学鉴定菌落颜色为米色或淡黄色，边
6、缘整齐，半透明，表面湿润、光滑。8. 3.2分子生物学鉴定7.3.2.1PCR模板的制备接种环挑选培养基上待检菌的单独菌落，置于0.5ml灭菌生理盐水中，4000rmin离心2min,弃上清。再加0.5mL无菌水重悬并涡旋混匀，100C沸水中煮沸IOnlin后，移至冰面上,冷却后4000rmin离心30s,取上清液作为PCR模板待用。7.3.2.2PCR反应体系的配制根据PCR试剂用量，配制PCR反应体系。7.3.2.3PCR反应条件16SrRNA扩增条件：95C预变性5min,94变性30s,64退火30s,72C延伸90s,共32个循环，最后72C延伸10min。gyrB扩增条件：95预变
7、性5min,94变性30s,64C退火30s,72延伸30s,共32个循环，最后72延伸10min。取5双PCR扩增产物和IRL上样缓冲液，混匀后加入L2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白孔加入Marker标准品。电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上，打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像观察，确定PCR效果。7.3.2.5基因序列测序将扩增产物进行基因序列的测定，在NCBl对比，与已有基因同源性高于98%即可确定为米尔伊丽莎白菌。8菌种保存及生物安全为了保护实验室人员的安全，应由具备专业知识的人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照GB/T19489及国家有关规定执行。菌种应由具备专业相关资质的实验室根据动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法中国微生物菌种保藏管理条例进行妥善保存。
