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1、消毒剂中和剂鉴定试验报告（模板）1试验目的简要描述试验目的。2试验依据本试验依据兽用消毒剂鉴定技术规范（农牧药字（1992）第IOl号）、消毒剂实验室杀菌效果检验方法（GB/T385022020）设计；本试验遵从兽药临床试验质量管理规范（农业部公告（2015）第2337号）实施。3试验时间描述试验起止时间及各步骤实施时间。4试验场所描述试验实施场所的地址。5试验人员列明试验参与人员及相应分工。6总体试验设计描述试验总体思路，包括试验分组、菌株类型、消毒剂浓度水平、评价指标等试验设计信息。7试验材料7.1 试验药物提供受试消毒剂的产品名称、活性成分、含量规格、使用方法、批号、生产单位、生产日期、
2、有效期、储存条件等信息。7.2 试验菌株提供菌株的名称及来源。7.3 主要试剂、仪器和耗材7.3.1 中和剂提供中和剂配方并描述其制备方法。7.3.2 缓冲液提供缓冲液配方并描述其制备方法。7.3.3 培养基与试剂提供名称、批号、生产单位等。7.3.4 仪器与耗材提供名称、型号（规格）、生产厂家等。8试验方法8.1 用于细菌和真菌杀灭试验试验原则或要求（1）结合消毒剂选择中和剂悬液定量鉴定试验或中和剂载体定量鉴定试验。（2）中和剂鉴定所用消毒剂浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度。（3）同一消毒剂对多种微生物进行杀灭试验时,所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验：a）对细菌繁殖体，在金黄色葡萄球
3、菌（ATCC6538）、大肠杆菌（ATCC8099）、多杀性巴氏杆菌（禽株）、溶血性链球菌C型中任选其一进行中和剂鉴定试验；b）对细菌芽范如蜡样杆菌（SSIC11）类炭疽杆菌（8008）枯草杆菌黑色变种芽抱（ArCC9372）卜真菌（如白色念珠菌ATCC10231）,分枝杆菌（如单分枝菌）应分别进行鉴定试验。c）用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂鉴定试验。（4）试验应重复3次。重复性试验不是只在同次试验中增加片数，或多作几份样本，而是应分期分批进行。必要的器材和试剂应重新制备或灭菌，以防产生系统性误差。（5）对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白
4、蛋白的浓度为3.0%；对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为0.3%；对用于经过严格清洗或极清洁的消毒对象的消毒剂，可不使用有机干扰物。试验分组按表1设置中和剂鉴定试验组别。表1中和剂鉴定试验内容试验组别说明问题1消毒剂+菌液证明消毒剂在试验浓度下是否有杀菌或抑菌作用。2（消毒剂+菌液）+中和剂证明中和剂能否中和残留消毒剂的抑菌作用。3中和剂+菌液证明中和剂有无抑菌作用。4（消毒剂+中和剂）+菌液证明消毒剂与中和剂的反应产物有无抑菌作用。5菌液证明菌种与培养基是否适宜。6中和剂+培养基证明试验材料或操作过程中是否污染8.1.1 中和剂悬液定量鉴定试验8.1.
5、试验菌悬液的制备8.2. 1.1.1细菌繁殖体菌悬液的制备（1）以无菌操作方式开封冻干菌种管，加入适量营养肉汤培养基使菌种融化分散。吸取少许菌悬液于适量营养肉汤培养基试管中（或菌种融化后直接在营养琼脂平板上接种划线），置361C培养1824h取上述第1代培养的菌悬液（或单菌落），划线接种于营养琼脂平板上划线培养，置361C培养1824h;挑取上述第2代培养物中的典型菌落，接种于营养琼脂斜面，置361C培养1824h,即为第3代培养物。（2）取第3代第8代的新鲜斜面培养物，加3.0ml5.0ml稀释液一般用胰蛋白陈生理盐水溶液（TPS）,酸化水用生理盐水加入试管内，反复吹洗，洗下菌苔,随后转移至
6、另一无菌试管中，电动器混匀20s（或在手掌上振打80次）使细菌悬浮均匀。（3）用细菌浓度比浊度法粗测上述初步制成的菌悬液含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需浓度，置4冰箱内备用。8.1.1.1.2细菌芽胞悬液的制备（1）以无菌操作方式开封冻干菌种管，加入适量营养肉汤培养基使菌种融化分散。吸取少许菌悬液于适量营养肉汤等培养基试管中，置361C培养1824ho取上述培养的第1代菌悬液，划线接种于营养琼脂平皿上划线培养，置361培养至24h,挑取上述第2代培养物中的典型单体菌落，接种于营养肉汤培养基，置361C培养至24h,即为第3代培养物。（2）取第3代第5代的1824h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中
7、（或中管琼脂斜面表面）营养琼脂基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基表面,再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置361C培养57天。（3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜（油镜）下镜检。当芽泡形成率达90%以上时，即可进行后续处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽狗形成率后再进行以下处理。改良芽抱染色法：用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54C56条件下，加热30min0取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。加0.5%沙黄
8、水溶液，染Imin。水洗，待干后镜检。芽也呈绿色，菌体呈红色。（4）加10.Oml无菌蒸储水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔，吸出再加5.0ml无菌蒸储水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min将烧瓶置45C水浴中24h,使菌自溶断链，分散成单个芽泡。用无菌棉花或纱布过滤芽抱悬液，清除其中的琼脂凝块。（5）将过滤后的芽抱悬液,置无菌离心管内，以3000rmin速度离心Iomin。弃上清液，加蒸锵水吹吸使芽抱重新悬浮，重复3遍。（6）将洗净的芽泡悬浮液放入含适量小玻璃珠的三角烧瓶内。80水浴中IOmin（或60C,30min）,以杀灭残余的细菌繁
9、殖体。待冷至室温后，保存于4C冰箱中备用。8.1.1.13 白色念珠菌悬液的制备（1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml10.Oml沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37培养18h24h,即为第3代培养物。将其密封后在4保存。2）试验时，取第3代斜面培养物在沙堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h
10、24h）,用5.0ml吸管吸取3.0ml5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。3）悬液杀菌试验时，试验用菌悬液的含菌量为lXl（CFUml-5XlO,CFU/ml（回收菌量为1X106CFUml-5106CFUml）,8.1.1.14 菌计数除有特殊规定外，一般使用下列倾注法。操作程序（1）先将菌液用比浊度法初步估测菌液含菌浓度。将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5ml稀释液。吸取上述菌悬液0.5ml依次做10倍系列稀释。必要时，还可作某稀释度的1
11、:1或1:4稀释。（2）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为15CFU300CFU者为宜），吸取其中混合均匀的菌悬液LOml加于无菌培养皿中，将15ml20ml的4045C的熔化营养琼脂培养基倾注于已加入样液的平皿内。每一稀释度接种3个平皿。一般需接种23个不同稀释度。（3）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置361C（或特定细菌繁殖体、芽泡适宜生长温度）温箱内培养，至培养规定时间（细菌繁殖体为48h,细菌芽抱为72h）,计数最终结果的菌落数。（4）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在30CFU300CFU的平板为准,每个
12、稀释度3个平板生长菌落数全合乎上述标准,则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释（未稀释的原液平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果）。（5）根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中的平均菌落数。操作误差测定平板间、稀释度间误差率不应超过10%。计算公式如下：平板间误差率二 100%（平板间菌落平均数一各平板菌落数）的绝对值之和各平板菌落数之和稀释度间误差率二100%（稀释度间菌落平均数-各稀释度菌落数）的绝对值之和各稀释度菌落数之和8.1.1.15 和剂鉴定试验步躲根据试
13、验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂按所需浓度配制好后，置20ClC水浴中待用。按前述步骤制备试验菌悬液。取2.0ml试验菌悬液于试管中，加入2.0ml有机干扰物质，制成含有机干扰物质的菌悬液，置20ClC水浴中备用。6组鉴定试验如下：（1）第1组。吸取LOmI含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20C1水浴中5min后，再吸加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用XXmin,吸此样液0.5ml加于含有4.5ml稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液LOm1,接种于平皿中，做活菌培养计数。（2）第2组。吸取LOmI含有机干扰物质试验菌悬液于试管内，置20土IC水浴中5min后，再吸
14、加4.0ml消毒剂于试管内，混匀。作用XXmin,吸此样液0.5ml加于含4.5ml中和剂溶液管中，混匀，作用IOmin0吸取该最终样液LOmI,接种于平皿中，做活菌培养计数。如平板生长菌落数均超过300个，应对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。（3）第3组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20。CIC水浴中5min后，加入0.4ml硬水,混匀。加入4.5ml中和剂，作用IOmin0用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取1.0ml,分别接种于平皿中，做活菌培养计数。（4）第4组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20C1C水浴中5
15、min后，吸加4.9ml中和产物溶液（以0.4ml消毒剂加4.5ml中和剂，作用Iomin配制而成）于试管内，混匀。作用IOmin,吸取该最终样液0.5ml,用中和产物溶液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取LOm1,分别接种于平皿中，做活菌培养计数。（5）第5组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20士1水浴中5min后，吸加0.4ml硬水于试管内，混匀。加入4.5ml稀释液，作用IOmin,用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取LOml,分别接种于平InI中，做活菌培养计数。（6）第6组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml20ml,培养观察。如出现细菌生长，提示试验材料或操作过程中可能有污染。应重新进行试验。8.1.2中和剂载体定量鉴定试验8.1.2.1 菌片（染菌载体）的制备（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。常用的载体材料有金属、玻璃、滤纸、棉布、聚四氟乙烯等。应根据消毒对象选择相应的材料，如手术器械选择不锈钢片，物体表面选择棉布片，非金属
