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1、输血科红细胞意外抗体筛查和鉴定标准操作规程1、目的：规范实验室工作人员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室红细胞意外抗体筛查与鉴定试验操作。3、职责3.1工作人员进行红细胞意外抗体筛查和鉴定试验技术操作应熟练掌握。4、红细胞以外抗体筛查试验4.1基本原理受血者有输血史、妊娠史或短期内需要大量输血时应该按照有关规定进行抗体的筛查和鉴定。如条件允许抗体筛选试验最好在交叉配血之前进行，以便对患者抗体的早期确认及鉴定临床上有意义的抗体,避免一些可能的异常情况而造成病情的延误。4.1.1红细胞意外抗体概念意外抗体是指抗-A、抗-B以外的红细胞血型抗体。意外抗体有
2、两种，包括同种抗体和自身抗体。自身抗体是指受血者体内产生的抗体，针对自己本身的红细胞抗原。这类抗体不仅仅与自身红细胞凝集，通常也与多数别人的红细胞发生凝集反应。如果抗体不是针对自身抗原，而是与同种异基因的红细胞发生反应，即与某些献血者的红细胞出现凝集反应，为同种抗体。ABO系统中的亚型，变异型的抗-A1和抗B抗体，也称为意外抗体。4.1.2红细胞意外抗体筛查方法所用检测方法必须能证实那些具有临床意义的不规则抗体。某种抗体是否具有临床意义取决于特殊临床状况和病人情况。如果某种特异性抗体能引起新生儿溶血病、明显的溶血性输血反应或使输入的红细胞存活时间缩短，即认为这种抗体有临床意义。在37或在抗球蛋
3、白试验中反应的抗体比仅在室温或室温以下反应的抗体可能更有意义。抗体筛选所针对的抗体可以是IgM类，也可以是IgG类。IgG类抗体主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生，在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞，必须通过特殊介质才能使致敏红细胞出现凝集反应。因此检测的方法必须包括盐水介质检测法和特殊介质检测法如：白蛋白介质法、低离子强度介质法(LISS),酶技术、抗球蛋白试验、聚凝胺(polbrene)促凝技术和凝胶实验(Geltest)等。除盐水介质以外，可按抗体的血清学特点和实验室的具体条件选择其中一种方法。4.2盐水介质法4.2.1方法原理IgM类意外抗体可在室温盐水介质中与具有对应抗原的
4、红细胞发生凝集反应，使用盐水介质法可以检测出受检者血清中是否存在IgM类意外抗体。4. 2.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、阅片灯箱、显微镜、试管架；2）试剂：2%-5%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、生理盐水；3.耗材：硬试管、一次性塑料滴管、记号笔等；5. 2.3标本要求1）推荐使用EDTA抗凝静脉血，也可以使用不抗凝静脉血，静脉血管条件不好或紧急情况下也可以使用动脉血，标本采集量23mL；2）标本标识清晰、准确；3）标本质量符合要求，无血液稀释、细菌污染，离心后无溶血及明显乳糜；4）标本原则上在检测前不保存，收到标本后应及时进行相关检测。4.2.4操
5、作步骤以使用3组抗体筛查试剂红细胞为例：1）取4支洁净试管，分别做好I、II、In和自身对照标记;2）每支试管中分别加入2滴患者血浆（或血清），再分别加入1滴相应2%-5%筛查红细胞和自身红细胞，混匀；3）使用血型血清学专用离心机100Og,离心15s；4）观察有无凝集或溶血，必要时显微镜下观察，并记录结果。4.2.5结果判定与解释1）结果判定标准阳性结果：红细胞形成凝集或发生溶血；阴性结果：红细胞无溶血，肉眼及镜下均未见凝集。表1玻片法红细胞凝集强度评分标准凝集强度评分结果描述4+12红细胞凝集成一大块，血清清晰透明3+10红细胞凝集成数大块，血清尚清晰2+8红细胞凝块分散成许多小块，周围可
6、见到游离红细胞1+5肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞士3镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞00镜下未见凝集，红细胞均匀分布1）结果解释自身对照管及I、n、In管均无凝集或溶血，表明未检出IgM意外抗体；自身对照管无凝集或溶血，I、II、III管中至少有1管出现凝集或溶血，表明受检者血清（或血浆）含有IgM同种意外抗体;自身对照管及I、II、III管均凝集，表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有IgM同种意外抗体；盐水介质试验阴性结果，不除外IgG类意外抗体存在。4.2.6注意事项盐水介质法通常只能检出IgM类抗体，所以不能常规单独采用盐水介质法检测红细胞意外抗体；2
7、.抗体筛查为阴性，并不意味着受检血清中一定没有意外抗体，一些低频抗体或有剂量效应的弱抗体可能会因实验条件和所选谱细胞不足而漏检。4.3凝聚胺法4.3.1方法原理红细胞表面带有大量的负电荷，使红细胞间相互排斥，不易凝集。当红细胞悬浮在电解质中时，阳离子会被红细胞上的负电荷所吸引，红细胞被扩散的双层离子云围绕形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用。凝聚胺技术首先利用低离子溶液降低反应介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进抗原和抗体结合。然后加入凝聚胺溶液，它是一种高价阳离子季核盐多聚物，液相中产生的正电荷能中和红细胞膜表面唾液酸带有的负电荷，使红细胞Zeta电位降低，红细胞
8、间距离缩短，在离心力作用下，红细胞发生可逆性、非特异性聚集。通过加入带有负电荷的柠檬酸盐重悬液，其负电荷具有能中和凝聚胺阳离子的作用，使红细胞非特异性聚集散开，结果为阴性；当红细胞上有IgG抗体结合时，其特异性凝聚是不可逆的，加入重悬液后仍呈现肉眼可见的凝集现象，即为阳性结果。4.3.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、显微镜、阅片灯箱、试管架；2）试剂：225%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、低离子介质溶液（LIM）、凝聚胺试剂溶液（PolybreneReagent）、重悬液、生理盐水；3. 耗材：硬试管、一次性塑料滴管、玻片、记号笔等。4. 3.3标本要求
9、同本节盐水介质法。5. 3.4操作步骤1）取4支洁净试管，分别做好I、II、III和自身对照标记；2）每支试管中分别加入2滴患者血浆（或血清），再分别加入1滴相应2%-5%筛查红细胞和自身红细胞，混匀；3）每管加入低离子介质溶液（LlM）0.65mL,混匀（加入量以及是否需要室温孵育，请参照试剂使用说明书），室温孵育Imin；4）每管再加入凝聚胺溶液2滴，混匀，10OOg离心15s,弃上清液，不要沥干，让管底残留约0.1mL液体，轻摇试管，肉眼观察有无凝集，有凝集可进行下一步试验，如无凝集可能试剂失效或离心条件不符合要求，需要查找原因后重做试验；5）每管中加入2滴重悬液；6）轻轻混匀，Imin
10、内观察凝集是否消失，有无溶血现象；7）疑为弱凝集反应时，取洁净玻片1张，用一次性塑料滴管从疑似弱凝集反应管内吸取1滴红细胞混悬液，滴放在玻片上，涂成薄层，在显微镜下观察，记录结果。4.3.5室内质控1）基本原则：每次质控试验应至少选择一个阳性对照质控品，一个阴性对照质控品。阳性质控品最好选择2+的反应强度；2）频次要求：推荐每批次试验进行室内质控；至少在每天试验开始前、试验中途更换试剂批号后应重做质控实验；3）操作要求：受检标本与质控品标本应采用完全相同试验操作步骤；4）可以选择商品化质控品，也可以利用实验室标本资源自制质控品；5）质控结果分析：质控结果与预期靶值相符，结果在控，受检标本检测结
11、果可用；质控结果与预期靶值不相符，结果失控，受检标本检测结果不可用，需查找原因、纠正影响因素后，重复检测。4.3.6室间质评按照要求参加国家级或省级输血相容性检测室间质量评价活动意外抗体筛查项目，成绩至少达到合格以上。出现成绩不合格时，实验室应停止该检测项目，认真分析、查找原因，制定并实施整改、预防措施，并在得出满意评估结果后，方可重新开展本检测项目。4.3.7结果判断与解释D结果判定标准：同本节盐水介质法。2）结果解释：自身对照管及I、II、In管均无凝集或溶血，表明未检出IgG意外抗体；自身对照管无凝集或溶血，I、II、III管中至少有1管出现凝集或溶血，表明受检者血清（或血浆）含有同种意
12、外抗体；自身对照管及I、II、In管均凝集者表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有同种意外抗体。4.3.8注意事项此方法较之盐水法在灵敏度上有了很大提高，但其根本还是一种非特异性促凝手段，仍不能使灵敏度达到最理想的临床应用水平。在使用该试验方法时应注意以下几点：1）凝聚胺法对Kell血型系统的抗体检测效果不理想，对抗-K敏感性低，容易发生漏检;2） IgM类意外抗体也可以在凝聚胺法试验中出现阳性结果，需要加做盐水介质试验，以区分阳性结果是由于单独IgG意外抗体所致,还是由于IgM联合IgG意外抗体所致；3）注意本方法存在的非特异性因素：试验过程中加样不准、反应时间不够、离心力不够及观察
13、结果时振摇过重或观察时间超过Imin都会造成假阴性结果；部分试验结果需在显微镜下观察，增加了结果判断的不确定性;对弱反应容易漏检，但假阳性相对较少。某些治疗过程、药物可影响本法抗体筛查试验结果：透析、介入、体外循环等治疗后患者血清（浆）中含大量肝素；消化道出血患者使用的酚磺乙胺（止血敏）：酚磺乙胺在水溶液中带负电荷，能使红细胞Zeta电位上升，致可逆凝集反应受到抑制，多加入凝聚胺溶液也无法完全排除干扰，遇到此类患者应在使用酚磺乙胺4-6h后重新抽取血液标本进行检测或更换其他试验方法；患者输入大量低分子右旋糖酎时出现缗钱状凝集。采用等量生理盐水置换法,此种凝集即会消失。4.4抗人球蛋白法4.4.
14、1方法原理在盐水介质中多数IgG血型抗体与红细胞膜上相应血型抗原结合后，只能发生致敏反应而不能出现肉眼可见的凝集反应。当加入抗人球蛋白试剂后，该抗体（二抗）可与多个包被在红细胞膜上的IgG类抗体（一抗）的FC段结合，通过抗人球蛋白的桥联作用，使致敏红细胞发生肉眼可见的凝集反应。目前许多商品化血型血清试剂为IgG型，需要在抗人球蛋白介质中鉴定对应血型抗原。4.4.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、水浴箱、显微镜、阅片灯箱、试管架；2）试剂：2%-5%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、抗人球蛋白试剂、生理盐水；3）耗材：硬试管、一次性塑料滴管、玻片及记号笔等。4.
15、4.3标本要求同本节盐水介质法。4.4.4操作步骤1）取小试管4只，标记并分别加入待检血浆或血清2滴。2）以上4管中分别加入抗体筛选细胞I、11、In以及自身红细胞悬液各1滴，混匀。3）立即以IOoOg离心15秒，肉眼观察结果。如果阴性则继续试验，如果阳性，则分析原因排除干扰后继续后续试验。4）置37水浴箱孵育30分钟，或者各管加LIM（lowionicStrengthmediUnl低离子强度介质）各2滴，置37C水浴箱孵育IOT5分钟，或者各管加LIM各10滴，置37水浴箱孵育1-3分钟。5）将各管中红细胞用生理盐水洗涤三次（红细胞洗涤程序见附件红细胞洗涤方法）6）各管加多特异性抗球蛋白试剂各1滴，混匀，以100Og离心15秒，肉眼判断红细胞凝集情况。7）如果红细胞均不凝集，则在任一试管中加入直抗阳性红细胞悬液1滴，立即以IOoOg离心15秒，肉眼判断红细胞凝集，如果红细胞不凝集则该试验无效。（直抗阳性红细胞的制备：见附件致敏红细胞的制备方法）4. 4.5室内质控同本节凝聚胺法。5. 4.6室间质评同本节凝聚胺法。6. 4.7结果判断与解释1）结果判定标准：同本节盐水介质法。2）结果解释：自身对照管及I、II、In管均无凝集或
