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1、1、氮蓝四噗（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SoD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定一一愈创木酚法3、CAT（过氧化氢酶）测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽复原酶（GR）的活力测定：6、O3产生速率的测定7、过氧化氢（H2O2）含量的测定碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、复原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定10、谷胱甘肽复原酶测定11MDAR（单脱氢抗坏血酸复原酶）活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素IndoleBAceticAcid（I
2、AA）AbscisicAcid（ABA）GA3和ZA的测定17、CDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3/5RACE扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）-氮蓝四嘤(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)【实验原理】SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn-SoD和CuZn-Se)D,它们都催化以下反响：由于超氧自wd由基(02一)为不稳定自由基，寿命极(万I()2-1211-l22I?短，测定SoD活性一般为间接方法。并利1,22口2。I2O2用各种呈色反响来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子0/，当参加NBT后，在光照条件
3、下，与超氧自由基反响生成单甲月替鲍，继而复原生成二甲月替,它是一种蓝色物质，在56Onm波长下有最大吸收。当参加SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和02,从而抑制了NBT光复原的进行，使蓝色二甲月药生成速度减慢。通过在反响液中参加不同量的SoD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光复原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .甲硫氨酸4.EDTA-Na25.核黄素6.氮蓝四哩(NBT)7.陶瓷小研钵8.4-5ml离心
4、管9.IOml玻璃试管(三)试剂1. 0.05molL磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：取NaHzPCU2比0(分子量156.01)31.2g。分别用蒸偌水定容到100Omlo0.05molLPBS(pH7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml,B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸储水定容至100om1。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818gMet用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。3. 3mMEDTA-Na2溶
5、液：称取0.1117gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mlo4. 60UM核黄素溶液：称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至IOom1,避光保存。5. 2.25mM氮蓝四(NBT)溶液：称取0.092gNBT用PBS定容至50ml,避光保存。【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml0.6ml、0.5mk0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12(X)Og下离心20min,上清夜即为SoD粗提液。2 .酶活性测定(1)反响混合液配制(以60个样为准)
6、：分别取配好的Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液6ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；(2)分别取3ml反响混合液和40l(可视情况调整)酶液于指形管中此即反响管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反响混合液和40UlPBS(不加酶液)作为最大光复原管，另1支加3ml反响混合液和401PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。(3)将试管置于光照培养箱中在4000Iux光照25下反响20min；(4)反响结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度(OD56o)3 .计算结果SOD活性单位以抑制NBT光化复原的50%为一个酶活单位(U),按下
7、式计算活性n=(ODma-OD56)ODmax2SOD总活性=(Ack-AE)V/(l2AckWVt)SOD比活力=SoD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW)；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;ACk为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml)；Vt为测定时的酶液用量(ml)；W为样品鲜重(g)；蛋白质含量单位为mg/g。【考前须知】1 .酶液提取须在4C下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2 .植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可参加聚乙烯毗咯烷酮(PVP)或PVPP等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3
8、.NBT反响液配好后过滤除去不溶物立即使用，假设置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4 .加反响液时最好在暗光下进行；5 .核黄素产生O*NBT复原为篮甲潜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40moln2s”,同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6 .测定活性时参加的酶量，以能抑制反响的50%为佳。（一个酶单位相当于引起反响液到达半抑制时酶的用量，即以能抑制反响50%的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反响液中加酶液与PBS调零差异不大，反响液调零与其它两个那么
9、有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:276-287.ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinter
10、rape（BrassicanapesL.）.J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定.愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .2-甲氧基酚4 .30%H225 .陶瓷小研钵6 .2ml离心管（三）试剂1. 0.2molL磷酸缓冲液（pH6.0）:A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4
11、12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馈水定容到IoOOm1。0.2molL磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)12.3ml和B母液(NaH2PO4)87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M,pH6.0);【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml(0.6ml、0.5mk0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离
12、心20min,上清夜即为酶粗提液。2 .酶活性测定反响混合液的配制：取50mlPBS(pH6.0,0.2M)缓冲液于烧杯中,参加28反愈创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后参加19l30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。(2)酶活性测定：取3ml反响液并参加40l酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，3 .计算结果以每minOD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。，按下式计算活性POD活性=(A470Vt)/(WVs0.01t)(ugFW)A470：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(
13、min)；Vt为提取酶液总体积(ml)；VS为测定时取用酶液体积(ml)。【考前须知】1 .反响液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。参加H2O2前注意溶液冷却，防止H22的挥发。2 .由于该反响迅速，参加酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L.Munoz-Munoz,EGarcia-Molina,P.A.Garcia-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.Garcfa-Canovas,J.N.Rodriguez-Lopez,EnzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedPhenOIS,尸。OdChemistry,Volume
14、113,Issue2,75March2009,Pages435-444EQuintaniIla-Guerrero,M.A.Duarte-Vazquez,B.E.Garcia-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado5Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnologyVolume99,Issue18,December2008,Pages8605-8611三CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(Catal
15、aSe,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化复原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,去除组织中的过氧化氢。H2O2在24Onm处有一个吸收顶峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反响溶液吸光度(A240)随反响时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料植物叶片等植物材料(三)试剂1 0.15molL磷酸缓冲液(pH7.0):取A母液(NazHPCU)228.75ml和B母液(NaHzPCh)146.25ml混合后用蒸储水定容至500ml。2 0.3%H2O2:吸取0.5ml30%的H2O2,用PBS(pH7.0)定容至50mL【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、1200Og下离心20min,上清夜即为CAT粗提液。2酶活性测定(1)反响混合液的配制：取10
